Programowanie płodu odpowiedzi immunologicznej i tkanki tłuszczowej przez otyłość matki (EpiFat)

CELUJE:

U noworodków urodzonych przez ciężarne z prawidłowym BMI (> 18,5 i <24,9) podczas pierwszej wizyty prenatalnej (<14 tygodni ciąży) (grupa referencyjna) oraz z otyłością przedciążową (BMI > 30 kg/m2) z niskim (zwykłe) spożycie DHA (200 mg/dzień) (Grupa MO) oraz kobietom otyłym przed ciążą suplementowanym wysoką dawką DHA (800 mg/dzień) (Grupa MO+DHA) będziemy:

• Zbadanie, czy suplementacja DHA przez matkę modyfikuje skład ciała noworodków i dzieci w wieku 4 miesięcy.
• Określenie, czy suplementacja DHA przez matkę w czasie ciąży modyfikuje równowagę krążących cytokin pro- i przeciwzapalnych oraz markerów metabolicznych u matki w czasie ciąży, płodu, łożyska i dziecka w wieku 4 miesięcy
• Określ, czy odpowiedź makrofagów na mediatory zapalne wiąże się ze zmienionymi markerami epigenetycznymi w pro- i przeciwzapalnych genach związanych z otyłością w monocytach płodowych matek otyłych i czy suplementacja DHA przez matkę odwraca ten fenotyp.
• Ustalenie, czy otyłość matki przekłada się na zmiany w całym genomie profilu metylacji DNA w monocytach płodu po urodzeniu oraz wpływ suplementacji matczynego DHA na ten efekt epigenetyczny.

METODOLOGIA. Badanie EpiFat jest zagnieżdżoną kohortą w badaniu Maternal otyłości Control ThrouGh Healthy NuTrition, MIGHT (PI: Dr. Garmendia NCT02574767). W badaniu MIGHT losowo przydzielono 1000 pacjentek, które rozpoczęły opiekę prenatalną przed 14 tygodniem ciąży, do jednej z czterech równoległych grup badawczych: 2 grupy otrzymywały 200 mg dziennie DHA (na bazie oleju Schizochytrium, 100% DHA, DSM) i 2 grupy 800 mg dziennie DHA, każda grupa miała grupę z i jedną bez domowej diety i interwencji związanych z aktywnością fizyczną.

Rekrutacja i obserwacja: Przy przyjęciu na oddział przedporodowy położne ze szpitala Dr. Sótero del Río zapraszają wszystkie kobiety w ciąży, które spełniają kryteria kwalifikacyjne, do udziału w tym badaniu i przeprowadzają proces świadomej zgody.

Po rekrutacji do badania EpiFat, w momencie porodu, położna pobiera próbki krwi pępowinowej i tkanki łożyska. Od 24 do 48 godz. po porodzie pacjentki odwiedza położna badawcza w celu wykonania antropometrii noworodka oraz zebrania danych socjodemograficznych i informacji klinicznych o stanie zdrowia kobiety i przebiegu porodu.

W wieku 4 miesięcy niemowlęta odwiedzają Centrum Badań nad Środowiskiem Żywienia i Zapobieganiem Przewlekłym Chorobom Związanym z Odżywianiem (CIAPEC od jego hiszpańskiego akronimu) z Instytutu Żywienia i Technologii Żywności (INTA od jego hiszpańskiego akronimu) w celu oceny antropometrii i skład ciała. Podczas tej wizyty pobierane są próbki krwi niemowlęcia (5 ml) i informacje o stanie zdrowia niemowlęcia. Ponadto wykonywana jest antropometria matczyna oraz badania dotyczące karmienia niemowląt i częstotliwości spożywania posiłków przez matkę.

Wielkość próbki:

Aby obliczyć wielkość próby dla procentu tkanki tłuszczowej (główny wynik), przyjęto średnią różnicę 2,5% i 3,0 SD, które zostały opisane przez Catalano. Biorąc pod uwagę moc 80% i wartość p 0,05, oszacowana wielkość próby wynosiła 45 osób na grupę. Obliczenia wykonano przy użyciu oprogramowania Statistics/Data Analysis STATA wersja 14.0 (Texas, USA). Biorąc pod uwagę 20% straty w celu obserwacji, wielkość próby dostosowano do 54 osób na grupę.

Nie opublikowano żadnych dowodów na drugorzędny wynik „reakcja zapalna wywołana epigenetycznie makrofagów noworodków in vitro”. Jednak poprzednie badania z naszej grupy wykazały, że: Dla % metylacji w promotorze IL-1β, wielkość próby 15 noworodków na grupę od matek o normalnej wadze i otyłych wystarczyła, aby znaleźć statystyczną różnicę między grupami, a dla IL -10 w makrofagach pochodzących z monocytów noworodków potrzebnych było 10 osobników na grupę. Dlatego dla tych wyników uznano, że wielkość próby wynosiła 15 osób na grupę.

NOWORODKI I MATKI ZMIENNE BADANIA.

Zmienne uwzględnione w badaniu to:

• Zmienne dotyczące noworodków/niemowląt: % tkanki tłuszczowej i odpowiedź zapalna sterowana epigenetycznie w makrofagach noworodków.
• Zmienne niezależne matek w okresie ciąży (14 i 24-28 tydzień ciąży): wiek matki (lata), BMI (kg/m2, klasyfikacja), masa ciała (kg), wzrost (m), wiek ciążowy (tydzień + dni) , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/ml), trójglicerydy, cholesterol, cholesterol LDL, VLDL, HDL (wszystkie w mg/dl), glikemia na czczo (mg/dl) i insuliny (pg/ml), HOMA-IR, adiponektyny (ug/ml), stężenia DHA w osoczu (μmol/l).
• Zmienne niezależne matki przy urodzeniu: przyrost masy ciała w ciąży (kg, klasyfikacja), rodzaj porodu, godziny porodu.
• Zmienne niezależne noworodka: płeć, wiek (tygodnie urodzeniowe, tygodnie postnatalne), masa ciała (g), długość (cm), obwód głowy (cm), wskaźnik stawowy (kg/m3), masa ciała dla wieku ciążowego (klasyfikacja), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), poziomy DHA w osoczu (μmol/l), fałdy skórne (mm) (biceps, triceps, podłopatkowy, nadłopatkowy i napięty).
• Inne zmienne matczyne: liczba porodów, nałóg palenia, wykształcenie (lata), rodzaj porodu, masa łożyska (g).

BADANIA EX VIVO I IN VITRO KRWI PĘPOWINOWEJ. Krew pępowinową pobiera się po porodzie i przed wydaleniem z łożyska do worków do pobierania krwi Terumo (40-100 ml) i przechowuje w temperaturze 4°C do czasu przetworzenia (w ciągu 1-5 godzin po porodzie).

POZIOMY DHA W KRWI MATKI I PŁODU: Zostaną one zmierzone w badaniu MIGHT za pomocą chromatografii gazowej.

IZOLACJA MONOCYTÓW, HODOWLA KOMÓRKOWA I RÓŻNICOWANIE MAKROFAGÓW. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) rozdziela się wkrótce po urodzeniu za pomocą gradientu gęstości Ficoll, stosując wirowanie Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) i inkubuje w pożywce RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) i wysiewa z gęstością 8 do 10 × 106 komórek/ml w 100 mm szalkach do hodowli przy 5% CO2 przez 2 godziny w 37°C. Tożsamość monocytów ocenia się za pomocą cytometrii przepływowej. Monocyty hoduje się przez 7 dni w celu oceny różnicowania makrofagów. Polaryzację makrofagów indukuje się przez 24-godzinną ekspozycję na 100 ng/ml LPS (SigmaAldrich, Missouri, USA) i 20 ng/ml INFγ (R&D Systems, Minneapolis, USA) dla M1 lub alternatywnie na 20 ng/ml IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, USA) dla M2 w pożywce RPMI uzupełnionej 5% FBS.

Komórki wysiewa się na plastikowe szalki hodowlane i utrzymuje w inkubatorze z kontrolowaną atmosferą, w temperaturze 37°C w różnych warunkach doświadczalnych.

OZNACZANIE ILOŚCIOWE CYTOKIN PRO- I PRZECIWZAPALNYCH, INSULINY, LEPTYNY I ADIPONEKTYNY W OSOCZU MATKI, NOWORODKA I NIEMOWLĘTA.

Te pro- i przeciwzapalne mediatory, leptynę i insulinę, oznacza się ilościowo za pomocą multipleksowanego (platforma Bio-Plex) testu immunometrycznego (panel ludzkich cytokin o wysokiej czułości MILLIPLEX xMAP i panel metaboliczny człowieka, Millipore, Billerica, MA, USA). Oznaczenie ilościowe całkowitej adiponektyny w osoczu krwi pępowinowej wykonuje się za pomocą zestawu High Molecular Weight & Total Adiponectin (ALPCO) ELISA, zgodnie z instrukcjami producenta.

PRZYGOTOWANIE HOMOGENATÓW ŁOŻYSKOWYCH. Łożyska są pobierane przy porodzie i ważone po przycięciu sznura i błon, natychmiast umieszczane w lodzie po porodzie i wycinane. Usunięto płytkę kosmówkową, worek owodniowy i doczesną. Około 50 g tkanki kosmków pocięto na małe kawałki i przepłukano lodowatym roztworem soli fizjologicznej. Tkanka zostanie umieszczona w lodowatym buforze D [250 mM sacharoza, 0,7 μM pepstatyna A, 1,6 μM przeciwbólowa, 80 μM aprotynina, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-Tris (pH 7,4)] w 4°C i homogenizowana na lodzie za pomocą politronu. Homogenat szybko zamraża się w ciekłym azocie i przechowuje w temperaturze -80°C do czasu analizy lub dalszej obróbki.

ILOŚCIOWY PCR DLA EKSPRESJI CYTOKIN IN VITRO. RNA izoluje się z monocytów przy użyciu komercyjnego zestawu (GenElute, Sigma), zgodnie z instrukcjami producenta. RT jest wykonywany z ImProm-II Reverse.

System transkrypcji (Promega). PCR przeprowadza się stosując startery oligonukleotydowe dla ludzkiego TNFα, IL-6, IL-1β, MCP-1 i IL-10. Poziomy mRNA dla GADPH, ATP5F1 i RPLP2 stosuje się jako odniesienia wewnętrzne. Startery są walidowane do użytku: sprawdzanie amplifikacji, stężeń starterów, wydajności starterów-HK i stabilności HK w warunkach doświadczalnych. Względną ekspresję genów docelowych oblicza się stosując metodę 2-delta delta ct.

CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA DO CHARATERIZACJI MONOCYTÓW. Ekspresję różnych markerów powierzchniowych ocenia się za pomocą cytometrii przepływowej, którą przeprowadza się albo w pełnej krwi w celu identyfikacji podtypów monocytów, albo w zróżnicowanych makrofagach in vitro w celu identyfikacji immunofenotypu. Wśród krążących monocytów (komórek CD86+) ocenia się podtypy klasyczne i nieklasyczne na podstawie ich powierzchniowej ekspresji CD14 i CD16.

Immunofenotyp makrofagów (tj. M1 i M2) ocenia się na podstawie ekspresji określonych markerów (np. produkcja CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFα, NO). Próbki są barwione w laboratorium i wysyłane do zakładu cytometrii przepływowej na Universidad de Chile (analizator CyAnTM ADP (Beckman Coulter®) w ciągu 48 godzin.

GLOBALNY METYLOM DNA. Analiza metylomu DNA została przeprowadzona we współpracy z dr Grahamem Burdge i dr Karen Lillycrop z Southampton przy użyciu zestawu Infinium Methylation EPIC BeadChip firmy Illumina.

ANALIZA METYLACJI DNA. Stan metylacji DNA regionów promotorowych (około 400 pz od miejsca startu transkrypcji) genów kodujących TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARγ i PCG1α zostanie określony za pomocą wodorosiarczynu modyfikacja połączona z sekwencjonowaniem DNA. W skrócie, całkowite ekstrakty DNA z komórek zostaną potraktowane wodorosiarczynem sodu w celu przekształcenia niemetylowanej cytozyny w uracyl, a regiony promotora zostaną zamplifikowane przez PCR przy użyciu specyficznych zgodnie ze strategią zastosowaną i opublikowaną przez naszą grupę. Pokrótce, jeden ze starterów PCR zostanie zaprojektowany wraz ze znacznikiem 5'-biotynowym, który umożliwi oczyszczenie amplikonu bezpośrednio z mieszaniny PCR. Następnie zamplifikowana nić DNA zawierająca biotynę zostanie przeniesiona do pirosekwencera PyroMark Q96 MD (Qiagen) w celu sekwencjonowania. Specyficzne dla miejsca metylacje CpG zostaną określone jako procent, porównując intensywność sygnału CpG niewrażliwego na wodorosiarczyny (Cpkonserwatywne, metylowane CpG) i CpG wrażliwego na wodorosiarczyny (przekształcone C→T, niemetylowane CpG).

ANALIZA STATYSTYCZNA. Do statystyk opisowych stosowana będzie średnia ± SD lub mediana i rozstęp międzykwartylowy dla zmiennych ilościowych, a procent z n dla kategorii. Rozkłady zostaną zweryfikowane testem Shapiro Wilka. Różnice w masie tłuszczu i krążących markerach zostaną określone za pomocą ANOVA lub Kruskala Wallisa zgodnie z rozkładem danych. Korelacja Spearmana (parametryczna) lub Pearsona (nieparametryczna) zostanie zastosowana do określenia związku między zmiennymi zależnymi i niezależnymi (matczynymi i noworodkowymi). Zmienne niezależne zostaną dopasowane do modeli logistycznych i regresji liniowej w celu oceny interakcji oraz zidentyfikowania czynników zakłócających. W przypadku badań in vitro porównania między dwiema lub więcej grupami zostaną przeprowadzone odpowiednio za pomocą testu t-Studenta dla niesparowanych grup i analizy wariancji (ANOVA). Jeśli ANOVA wykazuje istotną interakcję między zmiennymi, Dunns przeprowadził analizy post hoc podczas porównywania wybranych grup i testu korekty Bonferroniego z wielokrotnym porównaniem. Dane dotyczące odpowiedzi in vitro na cytokiny zostaną dopasowane do krzywych dawka-odpowiedź, z których uzyskana zostanie maksymalna odpowiedź i moc leku (pD2 = -Log EC50). Porównanie krzywych i maksymalnych odpowiedzi w różnych warunkach zostanie przeanalizowane za pomocą ANOVA. Wszystkie analizy zostaną przeprowadzone za pomocą oprogramowania statystycznego Graphpad Prism, STATA lub SPSS, przyjmując p<0,05 jako punkt odcięcia dla istotności statystycznej.