Fostrets programmering av immunsvar och kroppsfett av maternal fetma (EpiFat)

MÅL:

Hos nyfödda födda av gravida kvinnor med normalt BMI (> 18,5 och <24,9) vid det första prenatalbesöket (<14 veckors graviditet) (Referensgrupp) och med fetma före graviditeten (BMI >30 Kg/m2) med lågt (sedvanligt) DHA-intag (200 mg/dag) (MO-gruppen) och överviktiga kvinnor före graviditeten kompletterat med en hög dos av DHA (800 mg/dag) (MO+DHA-gruppen) kommer vi:

• Analysera om moderns DHA-tillskott ändrar kroppssammansättningen hos nyfödda och barn vid 4 månaders ålder.
• Bestäm om moderns tillskott med DHA under graviditeten ändrar balansen mellan cirkulerande pro- och antiinflammatoriska cytokiner och metabola markörer hos mamman under graviditeten, fostret, moderkakan och barnet vid 4 månaders ålder
• Bestäm om svaret från makrofager på inflammatoriska mediatorer associerar med förändrade epigenetiska markörer i pro- och antiinflammatoriska fetmarelaterade gener i fostermonocyter från överviktiga mödrar och om DHA maternellt tillskott återställer denna fenotyp.
• Bestäm om maternell fetma översätts till förändringar i den genomomfattande DNA-metyleringsprofilen i fostermonocyter vid födseln och effekten av moderns DHA-tillskott på denna epigenetiska effekt.

METODIK. EpiFat-studien är en kapslad kohort i Maternal Obesity Control ThrouGh Healthy NuTrition, MIGHT-studien (PI: Dr. Garmendia NCT02574767). MIGHT-studien randomiserade 1 000 patienter som påbörjade sin mödravård före 14 veckors graviditet till en av fyra parallella studiegrupper: 2 grupper fick 200 mg/dag DHA (baserat på Schizochytriumolja, 100 % DHA, DSM) och 2 grupper 800 mg/dag DHA, varje grupp hade en grupp med och en utan hembaserad kost och fysisk aktivitetsintervention.

Rekrytering och uppföljning: Vid intagning på enheten före förlossningen bjuder barnmorskor på sjukhuset Dr. Sótero del Río in alla gravida kvinnor som uppfyller behörighetskriterierna att delta i denna studie och genomför en process för informerat samtycke.

Efter rekrytering i EpiFat-studien, vid förlossningsögonblicket, samlar barnmorskan in navelsträngsblodprover och placentavävnaden. Mellan 24 och 48 timmar. efter förlossningen besöks patienter av forskningsbarnmorskan för att utföra antropometri till den nyfödda och samla in sociodemografisk data och klinisk information om kvinnors hälsa och förlossningsprocessen.

Vid 4 månader besöker spädbarnen forskningscentret för ätmiljö och förebyggande av associerade till nutrition kroniska sjukdomar (CIAPEC för hans spanska akronym) från Institute of Nutrition and Food Technology (INTA för hans spanska akronym), för att utvärdera antropometri. och kroppssammansättning. I detta besök samlas spädbarnsblodprover (5 ml) och spädbarnshälsostatus in. Vidare utförs maternell antropometri, och spädbarnsmatning och matfrekvensundersökningar tillämpas på modern.

Provstorlek:

För att beräkna provstorleken för kroppsfettprocent (primärt utfall) ansågs en genomsnittlig skillnad på 2,5% och 3,0 SD som beskrevs av Catalano. Med tanke på en styrka på 80 % och ett p-värde på 0,05 var uppskattningen av provstorleken 45 försökspersoner per grupp. Beräkningen gjordes med hjälp av programvaran Statistics/Data Analysis STATA version 14.0 (Texas, USA). Med tanke på en förlust på 20 % för att följa upp justerades provstorleken till 54 försökspersoner per grupp.

För det sekundära resultatet "det epigenetiskt drivna inflammatoriska svaret hos neonatala makrofager in vitro" finns inga bevis publicerade. Tidigare studier från vår grupp har dock visat att: För % av metylering i IL-1β-promotorn räckte en provstorlek på 15 nyfödda per grupp från normalviktiga och fetma mödrar för att hitta en statistisk skillnad mellan grupperna, och för IL -10 i makrofager härledda från neonatala monocyter behövdes 10 försökspersoner per grupp. Därför ansågs det för dessa resultat vara en urvalsstorlek på 15 försökspersoner per grupp.

STUDIENS NYFÖDA OCH MODERNA VARIABLER.

Variablerna som ingår i studien är:

• Variabler för nyfödda/spädbarn: % av kroppsfett & epigenetiskt driven inflammatorisk respons i neonatala makrofager.
• Oberoende variabler för mödrarna under graviditeten (vecka 14 och 24-28 av graviditeten): moderns ålder (år), BMI (kg/m2, klassificering), vikt (kg), längd (m), graviditetsålder (vecka + dagar) , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/ml), triglycerider, kolesterol, LDL-kolesterol, VLDL, HDL (alla i mg/dl), fastande glykemi (mg/dl) och insulin (pg/mL), HOMA-IR, adiponectin (ug/mL), plasmanivåer av DHA (μmol/l).
• Oberoende variabler för modern vid födseln: viktökning i graviditeten (kg, klassificering), typ av förlossning, arbetstimmar.
• Oberoende variabler för den nyfödda: kön, ålder (veckor vid födseln, veckor efter födseln), vikt (g), längd (cm), huvudomkrets (cm), ponderalt index (kg/m3), vikt för graviditetsålder (klassificering), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), plasmanivåer av DHA (μmol/l), hudveck (mm) (biceps, triceps, subscapular, suprailiac och tight).
• Andra moderns variabler: paritet, rökvana, utbildning (år), typ av förlossning, placentavikt (g).

EX VIVO & IN VITRO STUDIER NAVELNAVELNORDBLOD. Navelsträngsblod samlas upp efter förlossning och före placentautdrivning i Terumo-bloduppsamlingspåsar (40-100 ml) och förvaras vid 4°C fram till bearbetning (inom 1-5 timmar efter förlossningen).

DHA-NIVÅER I MATERNELLT OCH FETALT BLOD: Dessa kommer att mätas i MIGHT Study med gaskromatografi.

MONOCYTISOLERING, CELLKULTUR OCH MAKROFAGDIFERENTIERING. Mononukleära celler från perifert blod (PBMC) separeras kort efter födseln av Ficoll-densitetsgradient med användning av Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) centrifugering och inkuberas i RPMI 1640-medium (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) och sås vid densitet av 8 till 10 × 106 celler/ml i 100 mm odlingsskålar vid 5 % CO2 under 2 timmar vid 37°C. Monocytidentitet bedöms med flödescytometri. Monocyter odlas i 7 dagar för att bedöma makrofagdifferentiering. Makrofagerpolarisering induceras genom att under 24 timmar exponeras för 100 ng/ml LPS (SigmaAldrich, Missouri, USA) och 20 ng/ml INFγ (R&D Systems, Minneapolis, USA) för M1 eller, alternativt, för 20 ng/ml av IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, USA) för M2 i RPMI-medium kompletterat med 5 % FBS.

Celler sås på plastodlingsskålar och hålls i en inkubator med kontrollerad atmosfär, vid 37°C med olika experimentella betingelser.

KVANTIFIERING AV PRO- OCH ANTI-INFLAMMATORISKA CYTOKINER, INSULIN, LEPTIN OCH ADIPONEKTIN I MATERNAL, NEONATAL OCH SPÄDDAPLASMA.

Dessa pro- och antiinflammatoriska mediatorer, leptin och insulin kvantifieras med hjälp av en multiplexerad (Bio-Plex-plattform) immunometrisk analys (MILLIPLEX xMAP High Sensitivity Human Cytokine Panel, och human metabolic panel, Millipore, Billerica, MA, USA). Kvantifiering av totalt adiponektin i navelsträngsplasma görs med High Molecular Weight & Total Adiponectin (ALPCO) ELISA-kit, enligt tillverkarens instruktioner.

BEREDNING AV PLACENTAL HOMOGENAT. Placentor samlas upp vid förlossningen och vägs efter trimning av snöret och membranen, placeras omedelbart på is efter förlossningen och dissekeras. Korionplattan, fostersäcken och decidua avlägsnades. Cirka 50 g villös vävnad skärs i små bitar och sköljs med iskall fysiologisk saltlösning. Vävnad kommer att placeras i iskall buffert D [250 mM sackaros, 0,7 μM pepstatin A, 1,6 μM antismärta, 80 μM aprotinin, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-Tris (pH 7,4)] vid 4°C och homogeniserad på is med användning av en polytron. Homogenatet snabbfryses i flytande kväve och förvaras vid -80°C fram till analys eller vidare bearbetning.

KVANTITATIV PCR FÖR IN VITRO EXPRESSION AV CYTOKINER. RNA isoleras från monocyter med användning av ett kommersiellt kit (GenElute, Sigma), enligt tillverkarens instruktioner. RT utförs med ImProm-II Reverse.

Transkriptionssystem (Promega). PCR utförs med användning av oligonukleotidprimrar för human TNFa, IL-6, Il-lp, MCP-1 och IL-10. Nivåerna av mRNA för GADPH, ATP5F1 och RPLP2 används som interna referenser. Primers är validerade för användning: kontroll av amplifiering, primerkoncentrationer, effektivitetsprimers-HK och stabilitet av HK under experimentella förhållanden. Relativt uttryck av målgener beräknas med hjälp av 2-delta delta ct-metoden.

FLÖDESCYTOMETRI FÖR KARATERISERING AV MONOCYTER. Uttrycket av olika ytmarkörer utvärderas med flödescytometri, som utförs antingen i helblod för identifiering av monocytsubtyper eller in vitro differentierade makrofager för identifiering av immunfenotypen. Bland cirkulerande monocyter (CD86+-celler) bedöms klassiska och icke-klassiska subtyper enligt deras ytuttryck av CD14 och CD16.

Immunfenotyp av makrofager (dvs. M1 och M2) bedöms enligt uttrycket av specifika markörer (t.ex. CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFa, NO produktion). Proverna färgas i laboratoriet och skickas till en flödescytometrianläggning vid Universidad de Chile (CyAnTM ADP-analysator (Beckman Coulter®), inom 48 timmar.

GLOBAL DNA METYLOME. DNA Methylome-analysen görs i samarbete med Dr. Graham Burdge och Dr. Karen Lillycrop från Southampton med hjälp av Infinium Methylation EPIC BeadChip-kit från Illumina.

DNA METYLERINGSANALYS. DNA-metyleringsstatus för promotorregionerna (ungefär 400 bp från transkriptionsstartstället) för generna som kodar för TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARγ och PCG1α kommer att bestämmas med hjälp av bisulfit modifiering kopplad till DNA-sekvensering. Kortfattat kommer totala DNA-extrakt från celler att behandlas med natriumbisulfit för att omvandla icke-metylerat cytosin till uracil, och promotorregioner kommer att amplifieras med PCR med användning av specifika enligt den strategi som används och publiceras av vår grupp. Kortfattat kommer en av PCR-primrarna att utformas inklusive en 5'-biotin-tagg, som kommer att möjliggöra rening av amplikonet direkt från PCR-blandningen. Sedan kommer biotininnehållande amplifierad DNA-sträng att överföras till en PyroMark Q96 MD pyrosequencer (Qiagen) för sekvensering. Platsspecifika CpG-metyleringar kommer att bestämmas i procent, genom att jämföra signalintensiteten för icke-bisulfitkänslig CpG (konserverad C, metylerad CpG) och bisulfitkänslig CpG (konverterad C→T, ometylerad CpG).

STATISTISK ANALYS. För beskrivande statistik kommer medelvärde ± SD eller median- och interkvartilintervall att användas för kvantitativa variabler, och procent med n för kategorier. Distributionerna kommer att verifieras med ett Shapiro Wilk-test. Skillnader i fettmassa och cirkulerande markörer kommer att bestämmas av ANOVA eller Kruskal Wallis enligt datafördelning. Spearman (parametrisk) eller Pearson (ingen parametrisk) korrelation kommer att tillämpas för att bestämma sambandet mellan beroende och oberoende (maternala och neonatala) variabler. Oberoende variabler kommer att anpassas till logistiska och linjära regressionsmodeller för att utvärdera interaktioner samt för att identifiera störande faktorer. För in vitro-studier kommer jämförelser mellan två eller flera grupper att utföras med hjälp av Students oparade t-test respektive variansanalys (ANOVA). Om ANOVA visar en signifikant interaktion mellan variabler, utfördes post hoc-analyser av Dunns vid jämförelse av utvalda grupper och Bonferroni-korrektionstest med flera jämförelser. Data för in vitro-svar på cytokiner kommer att anpassas till dos-responskurvor från vilka maximal respons och läkemedelsstyrka (pD2 = -Log EC50) kommer att erhållas. Jämförelse av kurvor och maximala svar under olika förhållanden kommer att analyseras med ANOVA. Alla analyser kommer att utföras med den statistiska programvaran Graphpad Prism, STATA eller SPSS med hänsyn till ett p<0,05 som cut-off för statistisk signifikans.