산모의 비만에 따른 면역반응과 체지방의 태아 프로그래밍 (EpiFat)

목표:

첫 번째 산전 방문(임신 14주 미만)에서 BMI가 정상(>18.5 및 <24,9)이고 임신 전 비만(BMI >30 Kg/m2)과 (일반적인) DHA 섭취량(200mg/일)(MO 그룹) 및 고용량 DHA(800mg/일)로 보충된 임신 전 비만 여성(MO+DHA 그룹):

• 산모의 DHA 보충이 생후 4개월의 신생아와 어린이의 신체 구성을 수정하는지 여부를 분석합니다.
• 임신 중 산모의 DHA 보충이 임신 중 산모, 태아, 태반 및 생후 4개월의 소아에서 순환하는 프로 및 항염증성 사이토카인과 대사 마커의 균형을 수정하는지 여부를 확인합니다.
• 염증 매개체에 대한 대식세포의 반응이 비만 산모의 태아 단핵구에서 프로 및 항염증성 비만 관련 유전자의 변경된 후생유전학적 마커와 연관되는지 여부와 DHA 모체 보충이 이 표현형을 되돌리는지 여부를 결정합니다.
• 산모의 비만이 출생 시 태아 단핵구의 게놈 전체 DNA 메틸화 프로파일의 변화로 해석되는지 여부와 산모의 DHA 보충이 이 후생유전학적 효과에 미치는 영향을 확인합니다.

방법론. EpiFat 연구는 산모 비만 통제 ThrouGh Healthy nuTrition, MIGHT 연구(PI: Dr. Garmendia NCT02574767)의 내포 코호트입니다. MIGHT 연구는 임신 14주 이전에 산전 관리를 시작한 1000명의 환자를 4개의 병행 연구 군 중 하나로 무작위 배정했습니다. DHA, 각 그룹에는 가정 기반 식단 및 신체 활동 개입이 있는 그룹과 없는 그룹이 있습니다.

모집 및 후속 조치: 분만 전 병동에 입원할 때 Dr. Sótero del Río 병원의 조산사는 자격 기준을 충족하는 모든 임산부를 이 연구에 참여하도록 초대하고 정보에 입각한 동의 절차를 수행합니다.

EpiFat 연구에 모집한 후 분만 시 조산사는 제대혈 샘플과 태반 조직을 수집합니다. 24~48시간 사이. 분만 후에는 연구 조산사가 환자를 방문하여 신생아에 대한 인체 측정을 ​​수행하고 여성 건강 및 분만 과정에 대한 사회인구학적 데이터와 임상 정보를 수집합니다.

4개월에 영아는 인체 측정을 ​​평가하기 위해 영양 및 식품 기술 연구소(Institute of Nutrition and Food Technology)(스페인어 약어: INTA)의 섭식 환경 및 영양 만성 질환과 관련된 예방 연구 센터(스페인어 약어: CIAPEC)를 방문합니다. 그리고 체성분. 이 방문에서 영아 혈액 샘플(5ml.) 및 영아 건강 상태 정보가 수집됩니다. 또한 산모의 인체 측정을 ​​실시하고 산모에게 영유아 수유 및 음식 빈도 조사를 적용합니다.

표본의 크기:

체지방률(1차 결과)에 대한 표본 크기를 계산하기 위해 Catalano에 의해 기술된 2.5% 및 3.0 SD의 평균 차이로 간주되었습니다. 80%의 검정력과 0.05의 p-값을 고려하면 표본 크기 추정은 그룹당 45명의 피험자였습니다. 통계/데이터 분석 소프트웨어 STATA 버전 14.0(Texas, USA)을 사용하여 계산했습니다. 후속 조치를 위한 20%의 손실을 고려하여 샘플 크기를 그룹당 54명의 대상으로 조정했습니다.

2차 결과 "신생아 대식세포의 시험관 내 후생유전학적 염증 반응"에 대해서는 발표된 증거가 없습니다. 그러나 우리 그룹의 이전 연구에 따르면 IL-1β 프로모터의 메틸화 %의 경우 정상 체중과 비만 산모의 그룹당 신생아 15명의 표본 크기는 그룹 간의 통계적 차이를 발견하기에 충분했으며 IL의 경우 신생아 단핵구로부터 유래된 대식세포에서 -10은 그룹당 10명의 피험자가 필요했습니다. 따라서 이러한 결과에 대해 그룹당 15명의 피험자의 표본 크기로 간주되었습니다.

연구의 신생아 및 산모 변수.

연구에 포함된 변수는 다음과 같습니다.

• 신생아/영아의 변수: 신생아 대식세포의 체지방 % 및 후성유전적 염증 반응.
• 임신 중 산모의 독립변수(임신 14주 및 24-28주): 산모 연령(세), BMI(kg/m2, 분류), 체중(kg), 신장(m), 재태 연령(주 + 일) , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10(pg/mL), 중성지방, 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, VLDL, HDL(모두 mg/dl), 공복 혈당(mg/dL) 및 인슐린(pg/mL), HOMA-IR, 아디포넥틴(ug/mL), 혈장 DHA 수준(μmol/l).
• 출생 시 산모의 독립 변수: 임신 중 체중 증가(kg, 분류), 분만 유형, 분만 시간.
• 신생아의 독립변수: 성별, 연령(출생주수, 출생후주수), 체중(g), 체장(cm), 머리둘레(cm), 기저지수(kg/m3), 재태주령에 따른 체중(분류), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10(pg/mL), 혈장 DHA 수준(μmol/l), 피부주름(mm)(이두박근, 삼두근, 견갑하근, 상악근 및 조임).
• 기타 산모 변수: 출산력, 흡연 습관, 교육(년), 분만 유형, 태반 무게(g).

생체 외 및 체외 연구 제대혈. 제대혈은 분만 후 테루모 채혈 백(40-100ml)에 태반 만출 전에 채취하고 처리할 때까지(분만 후 1-5시간 이내) 4°C에서 보관합니다.

산모 및 태아 혈액의 DHA 수치: 가스 크로마토그래피에 의한 MIGHT 연구에서 측정됩니다.

단핵구 분리, 세포 배양 및 대식세포 분화. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 Histopaque-1077(Sigma-Aldrich, Missouri, US) 원심분리를 사용하여 출생 직후 Ficoll 밀도 구배에 의해 분리되고 RPMI 1640 배지(Sigma-Aldrich, Missouri, US)에서 배양되고 37°C에서 2시간 동안 5% CO2에서 100mm 배양 접시에서 8 ~ 10 × 106개 세포/mL. 단핵구 정체성은 유세포 분석법으로 평가합니다. 단핵구는 대식세포 분화를 평가하기 위해 7일 동안 배양됩니다. M1에 대해 100 ng/mL의 LPS(SigmaAldrich, Missouri, US) 및 20 ng/mL의 INFγ(R&D Systems, Minneapolis, US)에 24시간 동안 노출시키거나 대안적으로 20 ng/mL의 5% FBS가 보충된 RPMI 배지에서 M2에 대한 IL-4(R&D Systems, Minneapolis, US).

세포는 플라스틱 배양 접시에 시딩되고 다양한 실험 조건으로 37°C에서 제어된 분위기 인큐베이터에서 유지됩니다.

산모, 신생아 및 영아 혈장에서 프로 및 항염증성 사이토카인, 인슐린, 렙틴 및 아디포넥틴의 정량화.

이러한 프로 및 항염증 매개체, 렙틴 및 인슐린은 다중(Bio-Plex 플랫폼) 면역 측정 분석(MILLIPLEX xMAP 고감도 인간 사이토카인 패널 및 인간 대사 패널, Millipore, Billerica, MA, USA)을 사용하여 정량화됩니다. 탯줄 혈장에서 총 아디포넥틴의 정량화는 제조업체의 지침에 따라 고분자량 및 총 아디포넥틴(ALPCO) ELISA 키트를 사용하여 수행됩니다.

태반 균질액의 제조. 태반은 분만 시 수집되고 탯줄과 막을 다듬은 후 무게를 측정하고 분만 후 즉시 얼음 위에 놓고 해부합니다. 융모막판, 양막낭, 탈락막이 제거되었습니다. 약 50g의 융모 조직을 작은 조각으로 자르고 얼음처럼 차가운 생리 식염수로 헹굽니다. 조직을 4°C에서 빙냉 완충액 D[250mM 수크로스, 0.7μM 펩스타틴 A, 1.6μM 항통증제, 80μM 아프로티닌, 1mM EDTA, 10mM HEPES-Tris(pH 7.4)]에 넣고 얼음 위에서 균질화합니다. 폴리트론을 사용하여 균질액은 액체 질소에서 급속 동결되고 분석 또는 추가 처리가 될 때까지 -80°C에서 보관됩니다.

사이토카인의 체외 발현을 위한 정량적 PCR. 시판용 키트(GenElute, Sigma)를 사용하여 제조자 지침에 따라 단핵구로부터 RNA를 분리합니다. RT는 ImProm-II Reverse와 함께 수행됩니다.

전사 시스템(Promega). PCR은 인간 TNFα, IL-6, Il-1β, MCP-1 및 IL-10에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행됩니다. GADPH, ATP5F1 및 RPLP2에 대한 mRNA 수준은 내부 참조로 사용됩니다. 프라이머는 실험 조건에서 증폭, 프라이머 농도, 효율 프라이머-HK 및 HK의 안정성을 확인하여 사용이 검증되었습니다. 표적 유전자의 상대적인 발현은 2-델타 델타 방법을 사용하여 계산됩니다.

단핵구 특성화를 위한 유세포 분석. 상이한 표면 마커의 발현은 단핵구 아형의 식별을 위한 전혈 또는 면역표현형의 식별을 위한 시험관내 분화된 대식세포에서 수행되는 유동 세포측정법을 사용하여 평가된다. 순환하는 단핵구(CD86+ 세포) 중에서 고전적 및 비고전적 아형은 CD14 및 CD16의 표면 발현에 따라 평가됩니다.

대식세포의 면역 표현형(즉, M1 및 M2)는 특정 마커(예: CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFα, NO 생산). 샘플은 실험실에서 염색되고 48시간 이내에 Universidad de Chile(CyAnTM ADP 분석기(Beckman Coulter®))의 유세포 분석 시설로 보내집니다.

글로벌 DNA 메틸롬. DNA Methylome 분석은 Illumina의 Infinium Methylation EPIC BeadChip 키트를 사용하여 Southampton의 Graham Burdge 박사 및 Karen Lillycrop 박사와 협력하여 수행됩니다.

DNA 메틸화 분석. TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARγ 및 PCG1α를 암호화하는 유전자의 프로모터 영역(전사 시작 부위에서 약 400bp)의 DNA 메틸화 상태는 bisulfite를 사용하여 결정됩니다. DNA 시퀀싱과 결합된 변형. 간단히 말해서, 세포의 총 DNA 추출물은 아황산수소나트륨으로 처리되어 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 전환하고 프로모터 영역은 당사 그룹에서 사용 및 발표한 전략에 따라 특정 PCR을 사용하여 증폭됩니다. 간단히 말해서, PCR 프라이머 중 하나는 5'-비오틴 태그를 포함하도록 설계되어 PCR 믹스에서 직접 앰플리콘을 정제할 수 있습니다. 그런 다음 비오틴 함유 증폭 DNA 가닥을 시퀀싱을 위해 PyroMark Q96 MD 파이로시퀀서(Qiagen)로 옮깁니다. 부위 특이적 CpG 메틸화는 비-아황산염 민감성 CpG(보존된 C, 메틸화 CpG) 및 중아황산염 민감성 CpG(전환된 C→T, 비메틸화 CpG)의 신호 강도를 비교하여 백분율로 결정됩니다.

통계 분석. 기술 통계의 경우 정량적 변수의 경우 평균 ± SD 또는 중앙값 및 사분위수 범위가 적용되고 범주의 경우 n%가 적용됩니다. 분포는 Shapiro Wilk 테스트로 확인됩니다. 지방량 및 순환 마커의 차이는 데이터 분포에 따라 ANOVA 또는 Kruskal Wallis에 의해 결정됩니다. Spearman(모수) 또는 Pearson(모수 없음) 상관 관계를 적용하여 종속 변수와 독립 변수(산모 및 신생아) 간의 연관성을 결정합니다. 독립 변수는 로지스틱 및 선형 회귀 모델에 적합하여 상호 작용을 평가하고 교란 요인을 식별합니다. 시험관 내 연구의 경우, 둘 이상의 그룹 간의 비교는 각각 Student's unpaired t-test 및 분산 분석(ANOVA)을 통해 수행됩니다. ANOVA가 변수 간의 유의한 상호 작용을 입증하는 경우, Dunns는 선택한 그룹과 다중 비교 Bonferroni 보정 테스트를 비교할 때 사후 분석을 수행했습니다. 사이토카인에 대한 시험관 내 반응에 대한 데이터는 최대 반응 및 약물 효능(pD2 = -Log EC50)을 얻을 수 있는 용량-반응 곡선에 맞춰질 것입니다. 서로 다른 조건에서 곡선과 최대 응답의 비교는 ANOVA로 분석됩니다. 모든 분석은 통계적 유의성에 대한 컷오프로서 p<0.05를 고려하여 통계 소프트웨어 Graphpad Prism, STATA 또는 SPSS로 수행됩니다.