Programação Fetal da Resposta Imune e Gordura Corporal pela Obesidade Materna (EpiFat)

MIRA:

Em recém-nascidos de gestantes com IMC normal (> 18,5 e <24,9) na primeira consulta de pré-natal (<14 semanas de gestação) (Grupo Referência) e com obesidade pré-gestacional (IMC >30 Kg/m2) com baixa (habitual) ingestão de DHA (200 mg/dia) (Grupo MO) e mulheres obesas pré-gestacionais suplementadas com uma dose alta de DHA (800 mg/dia) (Grupo MO+DHA) iremos:

• Analisar se a suplementação materna de DHA modifica a composição corporal de neonatos e crianças aos 4 meses de idade.
• Determinar se a suplementação materna com DHA durante a gravidez modifica o equilíbrio das citocinas pró e anti-inflamatórias circulantes e marcadores metabólicos na mãe durante a gravidez, no feto, na placenta e na criança aos 4 meses de idade
• Determinar se a resposta de macrófagos a mediadores inflamatórios se associa a marcadores epigenéticos alterados em genes pró e anti-inflamatórios relacionados à obesidade em monócitos fetais de mães obesas e se a suplementação materna com DHA reverte esse fenótipo.
• Determine se a obesidade materna se traduz em mudanças no perfil de metilação do DNA em todo o genoma em monócitos fetais no nascimento e o impacto da suplementação materna de DHA sobre esse efeito epigenético.

METODOLOGIA. O estudo EpiFat é uma coorte aninhada no estudo MIGHT, controle da obesidade materna através da nutrição saudável (PI: Dr. Garmendia NCT02574767). O estudo MIGHT randomizou 1.000 pacientes que iniciaram o pré-natal antes de 14 semanas de gestação em um dos quatro braços paralelos do estudo: 2 grupos receberam 200 mg/dia de DHA (baseado em óleo de Schizochytrium, 100% DHA, DSM) e 2 grupos 800 mg/dia DHA, cada grupo tinha um grupo com e outro sem dieta caseira e intervenções de atividade física.

Recrutamento e acompanhamento: No momento da admissão na unidade de pré-parto, as parteiras do Hospital Dr. Sótero del Río convidam todas as grávidas que cumpram os critérios de elegibilidade a participar neste estudo e realizam o processo de consentimento informado.

Após o recrutamento no estudo EpiFat, no momento do parto, a parteira coleta amostras de sangue do cordão umbilical e do tecido da placenta. Entre 24 a 48 horas. após o parto, as pacientes são visitadas pela parteira da pesquisa para realizar a antropometria do recém-nascido e coletar dados sociodemográficos e informações clínicas sobre a saúde da mulher e o processo de parto.

Aos 4 meses os lactentes são visitados, no Centro de Investigação em Ambiente Alimentar e Prevenção de Doenças Crónicas Associadas à Nutrição (CIAPEC) do Instituto de Nutrição e Tecnologia Alimentar (INTA), para avaliação antropométrica e composição corporal. Nesta visita, são coletadas amostras de sangue do bebê (5 ml) e informações sobre o estado de saúde do bebê. Além disso, realiza-se a antropometria materna e são aplicados à mãe inquéritos sobre a alimentação infantil e a frequência alimentar.

Tamanho da amostra:

Para calcular o tamanho da amostra para percentual de gordura corporal (desfecho primário) foi considerada uma diferença média de 2,5% e 3,0 DP que foram descritos por Catalano. Considerando um poder de 80% e p-valor de 0,05, a estimativa do tamanho da amostra foi de 45 sujeitos por grupo. O cálculo foi feito por meio do software Statistics/Data Analysis STATA versão 14.0 (Texas, EUA). Considerando uma perda de seguimento de 20%, o tamanho da amostra foi ajustado para 54 indivíduos por grupo.

Para o desfecho secundário "a resposta inflamatória epigenética de macrófagos neonatais in vitro", não há evidências publicadas. No entanto, estudos anteriores do nosso grupo mostraram que: Para % de metilação no promotor de IL-1β, um tamanho amostral de 15 recém-nascidos por grupo de peso normal e mãe obesa foi suficiente para encontrar uma diferença estatística entre os grupos, e para IL -10 em macrófagos derivados de monócitos neonatais foram necessários 10 indivíduos por grupo. Portanto, para esses desfechos foi considerado um tamanho amostral de 15 sujeitos por grupo.

VARIÁVEIS RECÉM-NASCIDOS E MATERNOS DO ESTUDO.

As variáveis ​​incluídas no estudo são:

• Variáveis ​​de recém-nascidos/lactentes: % de gordura corporal e resposta inflamatória epigenética em macrófagos neonatais.
• Variáveis ​​independentes das mães durante a gravidez (14ª semana e 24-28ª semana de gravidez): idade materna (anos), IMC (kg/m2, classificação), peso (kg), altura (m), idade gestacional (semana + dias) , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), triglicerídeos, colesterol, LDL-colesterol, VLDL, HDL (todos em mg/dl), glicemia de jejum (mg/dL) e insulina (pg/mL), HOMA-IR, adiponectina (ug/mL), níveis plasmáticos de DHA (μmol/l).
• Variáveis ​​independentes da mãe ao nascer: ganho de peso gestacional (kg, classificação), tipo de parto, horas de trabalho de parto.
• Variáveis ​​independentes do recém-nascido: sexo, idade (semanas ao nascer, semanas pós-natal), peso (g), comprimento (cm), perímetro cefálico (cm), índice ponderal (kg/m3), peso para a idade gestacional (classificação), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), níveis plasmáticos de DHA (μmol/l), dobras cutâneas (mm) (bíceps, tríceps, subescapular, suprailíaca e apertada).
• Outras variáveis ​​maternas: paridade, tabagismo, escolaridade (anos), tipo de parto, peso da placenta (g).

ESTUDOS EX VIVO E IN VITRO SANGUE DE CORDÃO UMBILICAL. O sangue do cordão umbilical é coletado após o parto e antes da expulsão da placenta em bolsas de coleta de sangue Terumo (40-100 ml) e armazenado a 4°C até o processamento (dentro de 1-5 horas após o parto).

NÍVEIS DE DHA NO SANGUE MATERNO E FETAL: Serão medidos no estudo MIGHT por cromatografia gasosa.

ISOLAMENTO DE MONÓCITOS, CULTURA CELULAR E DIFERENCIAÇÃO DE MACRÓFAGOS. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são separadas logo após o nascimento por gradiente de densidade Ficoll usando centrifugação Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Missouri, EUA) e incubadas em meio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Missouri, EUA) e semeadas em densidade de 8 a 10 × 106 células/mL em placas de cultura de 100 mm a 5% de CO2 por 2 h a 37°C. A identidade dos monócitos é avaliada por citometria de fluxo. Os monócitos são cultivados durante 7 dias para avaliar a diferenciação de macrófagos. A polarização do macrófago é induzida pela exposição por 24 horas a 100 ng/mL de LPS (SigmaAldrich, Missouri, EUA) e 20 ng/mL de INFγ (R&D Systems, Minneapolis, EUA) para M1 ou, alternativamente, a 20 ng/mL de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, EUA) para M2 em meio RPMI suplementado com 5% de FBS.

As células são semeadas em placas de cultura de plástico e mantidas em incubadora de atmosfera controlada, a 37°C com diferentes condições experimentais.

QUANTIFICAÇÃO DE CITOCINAS PRÓ E ANTI-INFLAMATÓRIAS, INSULINA, LEPTINA E ADIPONECTIN NO PLASMA MATERNO, NEONATAL E INFANTIL.

Esses mediadores pró e antiinflamatórios, leptina e insulina, são quantificados usando um ensaio imunométrico multiplexado (plataforma Bio-Plex) (MILLIPLEX xMAP High Sensitivity Human Cytokine Panel e painel metabólico humano, Millipore, Billerica, MA, EUA). A quantificação da adiponectina total no plasma do cordão umbilical é feita com o kit ELISA de alto peso molecular e adiponectina total (ALPCO), de acordo com as instruções do fabricante.

PREPARAÇÃO DE HOMOGENADOS PLACENTÁRIOS. As placentas são coletadas no parto e pesadas após o corte do cordão e das membranas, imediatamente colocadas no gelo após o parto e dissecadas. A placa coriônica, o saco amniótico e a decídua foram removidos. Aproximadamente 50 g de tecido viloso são cortados em pequenos pedaços e lavados com soro fisiológico gelado. O tecido será colocado em tampão D gelado [250 mM de sacarose, 0,7 μM de pepstatina A, 1,6 μM de antidor, 80 μM de aprotinina, 1 mM de EDTA, 10 mM de HEPES-Tris (pH 7,4)] a 4°C e homogeneizado em gelo usando um polítron. O homogeneizado é congelado rapidamente em nitrogênio líquido e armazenado a -80°C até análise ou processamento posterior.

PCR QUANTITATIVO PARA EXPRESSÃO IN VITRO DE CITOCINAS. O RNA é isolado de monócitos usando um kit comercial (GenElute, Sigma), de acordo com as instruções do fabricante. O RT é executado com o ImProm-II Reverse.

Sistema de Transcrição (Promega). A PCR é realizada usando primers oligonucleotídicos para TNFα, IL-6, Il-1β, MCP-1 e IL-10 humanos. Os níveis de mRNAs para GADPH, ATP5F1 e RPLP2 são usados ​​como referências internas. Os primers são validados para uso: verificando a amplificação, as concentrações dos primers, a eficiência dos primers-HK e a estabilidade do HK em condições experimentais. A expressão relativa dos genes alvo é calculada usando o método 2-delta delta ct.

CITOMETRIA DE FLUXO PARA CARACTERIZAÇÃO DE MONÓCITOS. A expressão de diferentes marcadores de superfície é avaliada por citometria de fluxo, que é realizada em sangue total para identificação de subtipos de monócitos ou em macrófagos diferenciados in vitro para identificação do imunofenótipo. Entre os monócitos circulantes (células CD86+) os subtipos clássicos e não clássicos são avaliados de acordo com a expressão superficial de CD14 e CD16.

Imunofenótipo de macrófagos (i.e. M1 e ​​M2) são avaliados de acordo com a expressão de marcadores específicos (por exemplo, produção de CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFα, NO). As amostras são coradas no laboratório e enviadas para uma Unidade de Citometria de Fluxo da Universidad de Chile (analisador CyAnTM ADP (Beckman Coulter®), em 48 horas).

METILOMA DE DNA GLOBAL. A análise do DNA metiloma é feita em colaboração com o Dr. Graham Burdge e a Dra. Karen Lillycrop de Southampton usando o kit Infinium Methylation EPIC BeadChip da Illumina.

ANÁLISE DE METILAÇÃO DO DNA. O estado de metilação do DNA das regiões promotoras (aproximadamente 400 pb do sítio de início da transcrição) dos genes que codificam para TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARγ e PCG1α será determinado usando bissulfito modificação acoplada ao sequenciamento de DNA. Resumidamente, extratos de DNA total de células serão tratados com bissulfito de sódio para converter citosina não metilada em uracil, e regiões promotoras serão amplificadas por PCR utilizando-se técnicas específicas de acordo com a estratégia utilizada e publicada por nosso grupo. Resumidamente, um dos primers de PCR será desenhado incluindo uma tag 5'-biotina, que permitirá a purificação do amplicon diretamente da mistura de PCR. Em seguida, a fita de DNA amplificada contendo biotina será transferida para um pirosequenciador PyroMark Q96 MD (Qiagen) para sequenciamento. As metilações CpG específicas do local serão determinadas como porcentagem, comparando a intensidade do sinal de CpG não sensível a bissulfito (C conservado, CpG metilado) e CpG sensível a bissulfito (C→T convertido, CpG não metilado).

ANÁLISE ESTATÍSTICA. Para estatística descritiva será aplicada média ± DP ou mediana e intervalo interquartílico para variáveis ​​quantitativas, e porcentagem com n para categorias. As distribuições serão verificadas com um teste de Shapiro Wilk. Diferenças na massa gorda e nos marcadores circulantes serão determinadas por ANOVA ou Kruskal Wallis de acordo com a distribuição dos dados. A correlação de Spearman (paramétrica) ou Pearson (não paramétrica) será aplicada para determinar a associação entre variáveis ​​dependentes e independentes (maternas e neonatais). Variáveis ​​independentes serão ajustadas a modelos de regressão logística e linear para avaliar interações, bem como para identificar fatores de confusão. Para estudos in vitro, as comparações entre dois ou mais grupos serão realizadas por meio do teste t de Student não pareado e análise de variância (ANOVA), respectivamente. Caso a ANOVA demonstre interação significativa entre as variáveis, análises post hoc foram realizadas por Dunns na comparação dos grupos selecionados e teste de correção de Bonferroni de comparações múltiplas. Os dados das respostas in vitro às citocinas serão ajustados a curvas dose-resposta a partir das quais serão obtidas a resposta máxima e a potência da droga (pD2 = -Log EC50). A comparação das curvas e respostas máximas em diferentes condições será analisada por ANOVA. Todas as análises serão realizadas com os softwares estatísticos Graphpad Prism, STATA ou SPSS considerando p<0,05 como ponto de corte para significância estatística.