Programación Fetal de Respuesta Inmune y Grasa Corporal por Obesidad Materna (EpiFat)

OBJETIVOS:

En recién nacidos de gestantes con IMC normal (> 18,5 y < 24,9) en la primera visita prenatal (< 14 semanas de gestación) (Grupo de Referencia) y con obesidad pregestacional (IMC > 30 Kg/m2) con bajo Ingesta (habitual) de DHA (200 mg/día) (Grupo MO) y mujeres obesas pregestacionales suplementadas con una dosis alta de DHA (800 mg/día) (Grupo MO+DHA):

• Analizar si la suplementación materna con DHA modifica la composición corporal en neonatos y niños a los 4 meses de edad.
• Determinar si la suplementación materna con DHA durante el embarazo modifica el equilibrio de citocinas pro y antiinflamatorias circulantes y marcadores metabólicos en la madre durante el embarazo, el feto, la placenta y el niño a los 4 meses de edad
• Determinar si la respuesta de los macrófagos a los mediadores inflamatorios se asocia con marcadores epigenéticos alterados en genes relacionados con la obesidad pro y antiinflamatorios en monocitos fetales de madres obesas y si la suplementación materna con DHA revierte este fenotipo.
• Determinar si la obesidad materna se traduce en cambios en el perfil de metilación del ADN de todo el genoma en los monocitos fetales al nacer y el impacto de la suplementación materna con DHA en este efecto epigenético.

METODOLOGÍA. El estudio EpiFat es una cohorte anidada en el estudio MIGHT para el control de la obesidad materna a través de una nutrición saludable (PI: Dr. Garmendia NCT02574767). El estudio MIGHT aleatorizó a 1000 pacientes que comenzaron su atención prenatal antes de las 14 semanas de gestación a uno de los cuatro brazos de estudio paralelos: 2 grupos recibieron 200 mg/día de DHA (basado en aceite de Schizochytrium, 100 % DHA, DSM) y 2 grupos recibieron 800 mg/día DHA, cada grupo tenía un grupo con y otro sin intervenciones de dieta y actividad física en el hogar.

Reclutamiento y seguimiento: Al ingreso a la unidad de preparto, las parteras del Hospital Dr. Sótero del Río invitan a todas las gestantes que cumplan con los criterios de elegibilidad a participar en este estudio y realiza proceso de consentimiento informado.

Después del reclutamiento en el estudio EpiFat, en el momento del parto, la partera recolecta muestras de sangre del cordón umbilical y el tejido de la placenta. Entre 24 a 48 hs. después del parto, las pacientes son visitadas por la partera de investigación para realizar la antropometría al recién nacido y recopilar datos sociodemográficos e información clínica sobre la salud de la mujer y el proceso de parto.

A los 4 meses los infantes tienen visita, en el Centro de Investigación en Ambiente Alimentario y Prevención de Enfermedades Crónicas Asociadas a la Nutrición (CIAPEC) del Instituto de Nutrición y Tecnología de Alimentos (INTA), para evaluar antropometría y composición corporal. En esta visita se recolectan muestras de sangre infantil (5 ml.) e información sobre el estado de salud del lactante. Además, se realiza antropometría materna y se aplica a la madre encuestas sobre alimentación infantil y frecuencia alimentaria.

Tamaño de la muestra:

Para calcular el tamaño de la muestra para el porcentaje de grasa corporal (resultado primario) se consideró una diferencia de medias de 2,5% y 3,0 DE que fueron descritos por Catalano. Considerando una potencia del 80% y un valor de p de 0,05, la estimación del tamaño de la muestra fue de 45 sujetos por grupo. El cálculo se realizó mediante el software Statistics/Data Analysis STATA versión 14.0 (Texas, EE. UU.). Considerando un 20% de pérdida de seguimiento, el tamaño de la muestra se ajustó a 54 sujetos por grupo.

Para el resultado secundario "la respuesta inflamatoria impulsada por la epigenética de los macrófagos neonatales in vitro" no hay evidencia publicada. Sin embargo, estudios previos de nuestro grupo han demostrado que: Para % de metilación en el promotor de IL-1β, un tamaño de muestra de 15 recién nacidos por grupo de madre normopeso y obesa fue suficiente para encontrar una diferencia estadística entre los grupos, y para IL -10 en macrófagos derivados de monocitos neonatales Se necesitaron 10 sujetos por grupo. Por lo tanto, para estos resultados se consideró un tamaño de muestra de 15 sujetos por grupo.

VARIABLES RECIÉN NACIDAS Y MATERNAS DEL ESTUDIO.

Las variables incluidas en el estudio son:

• Variables de recién nacidos/lactantes: % de grasa corporal y respuesta inflamatoria de origen epigenético en macrófagos neonatales.
• Variables independientes de las madres durante el embarazo (semana 14 y 24-28 de embarazo): edad materna (años), IMC (kg/m2, clasificación), peso (kg), talla (m), edad gestacional (semana + días) , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), triglicéridos, colesterol, LDL-colesterol, VLDL, HDL (todo en mg/dl), glucemia en ayunas (mg/dL) e insulina (pg/mL), HOMA-IR, adiponectina (ug/mL), niveles plasmáticos de DHA (μmol/l).
• Variables independientes de la madre al nacer: ganancia de peso gestacional (kg, clasificación), tipo de parto, horas de trabajo de parto.
• Variables independientes del recién nacido: sexo, edad (semanas al nacimiento, semanas postnatales), peso (g), talla (cm), perímetro cefálico (cm), índice ponderal (kg/m3), peso para la edad gestacional (clasificación), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), niveles plasmáticos de DHA (μmol/l), pliegues cutáneos (mm) (bíceps, tríceps, subescapular, suprailíaco y tenso).
• Otras variables maternas: paridad, tabaquismo, escolaridad (años), tipo de parto, peso placentario (g).

ESTUDIOS EX VIVO E IN VITRO SANGRE DEL CORDÓN UMBILICAL. La sangre del cordón umbilical se recoge después del parto y antes de la expulsión de la placenta en bolsas de recogida de sangre Terumo (40-100 ml) y se almacena a 4 °C hasta su procesamiento (dentro de 1-5 horas después del parto).

NIVELES DE DHA EN SANGRE MATERNA Y FETAL: Estos se medirán en MIGHT Estudio por cromatografía de gases.

AISLAMIENTO DE MONOCITOS, CULTIVO CELULAR Y DIFERENCIACIÓN DE MACROFAGOS. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se separan poco después del nacimiento mediante un gradiente de densidad de Ficoll mediante centrifugación con Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Missouri, EE. UU.), se incuban en medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Missouri, EE. UU.) y se siembran a una densidad de 8 a 10 × 106 células/ml en placas de cultivo de 100 mm al 5 % de CO2 durante 2 h a 37 °C. La identidad de los monocitos se evalúa mediante citometría de flujo. Los monocitos se cultivan durante 7 días para evaluar la diferenciación de macrófagos. La polarización de los macrófagos se induce al exponer durante 24 horas a 100 ng/mL de LPS (SigmaAldrich, Missouri, EE. UU.) y 20 ng/mL de INFγ (R&D Systems, Minneapolis, EE. UU.) para M1 o, alternativamente, a 20 ng/mL de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, EE. UU.) para M2 en medio RPMI suplementado con 5% de FBS.

Las células se siembran en placas de cultivo de plástico y se mantienen en una incubadora de atmósfera controlada, a 37°C con diferentes condiciones experimentales.

CUANTIFICACIÓN DE CITOQUINAS PRO Y ANTIINFLAMATORIAS, INSULINA, LEPTINA Y ADIPONECTINA EN PLASMA MATERNO, NEONATAL E INFANTIL.

Estos mediadores pro y antiinflamatorios, la leptina y la insulina se cuantifican mediante un ensayo inmunométrico multiplexado (plataforma Bio-Plex) (MILLIPLEX xMAP High Sensitivity Human Cytokine Panel y panel metabólico humano, Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). La cuantificación de adiponectina total en plasma de cordón umbilical se realiza con el kit ELISA de alto peso molecular y adiponectina total (ALPCO), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

PREPARACIÓN DE HOMOGENEADOS DE PLACENTA. Las placentas se recogen en el momento del parto y se pesan después de recortar el cordón y las membranas, se colocan en hielo inmediatamente después del parto y se diseccionan. Se extirparon la placa coriónica, el saco amniótico y la decidua. Aproximadamente 50 g de tejido velloso se cortan en trozos pequeños y se enjuagan con solución salina fisiológica helada. El tejido se colocará en tampón D enfriado con hielo [sacarosa 250 mM, pepstatina A 0,7 μM, antipain 1,6 μM, aprotinina 80 μM, EDTA 1 mM, HEPES-Tris 10 mM (pH 7,4)] a 4 °C y homogeneizado en hielo utilizando un politrón. El homogeneizado se congela instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacena a -80°C hasta su análisis o procesamiento posterior.

PCR CUANTITATIVA PARA LA EXPRESIÓN DE CITOQUINAS IN VITRO. El ARN se aísla de los monocitos utilizando un kit comercial (GenElute, Sigma), según las instrucciones del fabricante. RT se realiza con ImProm-II Reverse.

Sistema de Transcripción (Promega). La PCR se lleva a cabo utilizando cebadores de oligonucleótidos para TNFα, IL-6, Il-1β, MCP-1 e IL-10 humanos. Los niveles de ARNm para GADPH, ATP5F1 y RPLP2 se utilizan como referencias internas. Los cebadores están validados para su uso: comprobando la amplificación, las concentraciones de cebadores, la eficacia de los cebadores-HK y la estabilidad de HK en condiciones experimentales. La expresión relativa de los genes diana se calcula utilizando el método 2-delta delta ct.

CITOMETRÍA DE FLUJO PARA CARATERIZACIÓN DE MONOCITOS. La expresión de diferentes marcadores de superficie se evalúa mediante citometría de flujo, que se realiza en sangre completa para la identificación de subtipos de monocitos o macrófagos diferenciados in vitro para la identificación del inmunofenotipo. Entre los monocitos circulantes (células CD86+), los subtipos clásicos y no clásicos se evalúan según su expresión superficial de CD14 y CD16.

Inmunofenotipo de macrófagos (es decir, M1 y M2) se evalúan según la expresión de marcadores específicos (p. CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFα, producción de NO). Las muestras se tiñen en el laboratorio y se envían a un Centro de Citometría de Flujo de la Universidad de Chile (analizador CyAnTM ADP (Beckman Coulter®), en un plazo de 48 horas.

METILOMA ADN GLOBAL. El análisis de metiloma de ADN se realiza en colaboración con el Dr. Graham Burdge y la Dra. Karen Lillycrop de Southampton utilizando el kit Infinium Methylation EPIC BeadChip de Illumina.

ANÁLISIS DE METILACIÓN DEL ADN. El estado de metilación del ADN de las regiones promotoras (aproximadamente 400 pb desde el sitio de inicio de la transcripción) de los genes que codifican TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARγ y PCG1α se determinará utilizando bisulfito. modificación acoplada a la secuenciación del ADN. En resumen, los extractos de ADN total de las células se tratarán con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo, y las regiones promotoras se amplificarán mediante PCR utilizando técnicas específicas de acuerdo con la estrategia utilizada y publicada por nuestro grupo. Brevemente, uno de los cebadores de PCR se diseñará incluyendo una etiqueta de biotina 5', que permitirá la purificación del amplicón directamente de la mezcla de PCR. Luego, la cadena de ADN amplificada que contiene biotina se transferirá a un pirosecuenciador PyroMark Q96 MD (Qiagen) para la secuenciación. Las metilaciones de CpG específicas del sitio se determinarán como porcentaje, comparando la intensidad de la señal de CpG no sensible al bisulfito (CpG conservado, CpG metilado) y CpG sensible al bisulfito (CpG convertido→T, CpG no metilado).

ANÁLISIS ESTADÍSTICO. Para estadística descriptiva se aplicará media ± DE o mediana y rango intercuartílico para variables cuantitativas, y porcentaje con n para categorías. Las distribuciones se verificarán con una prueba de Shapiro Wilk. Las diferencias en la masa grasa y los marcadores circulantes se determinarán mediante ANOVA o Kruskal Wallis según la distribución de datos. Se aplicará la correlación de Spearman (paramétrica) o de Pearson (no paramétrica) para determinar la asociación entre variables dependientes e independientes (maternas y neonatales). Las variables independientes se ajustarán a modelos de regresión logística y lineal para evaluar interacciones e identificar factores de confusión. Para estudios in vitro, las comparaciones entre dos o más grupos se realizarán mediante la prueba t de Student para datos no apareados y el análisis de varianza (ANOVA), respectivamente. Si el ANOVA demuestra una interacción significativa entre las variables, Dunns realizó análisis post hoc al comparar grupos seleccionados y la prueba de corrección de Bonferroni de comparación múltiple. Los datos de las respuestas in vitro a las citocinas se ajustarán a las curvas de dosis-respuesta a partir de las cuales se obtendrán la respuesta máxima y la potencia del fármaco (pD2 = -Log EC50). La comparación de curvas y respuestas máximas bajo diferentes condiciones será analizada por ANOVA. Todos los análisis se realizarán con el software estadístico Graphpad Prism, STATA o SPSS considerando una p<0,05 como punto de corte para la significación estadística.