Programmazione fetale della risposta immunitaria e grasso corporeo dall'obesità materna (EpiFat)

OBIETTIVI:

Nei neonati nati da gestanti con BMI normale (>18,5 e <24,9) alla prima visita prenatale (<14 settimane di gestazione) (Gruppo di riferimento) e con obesità pre-gestazionale (BMI >30 Kg/m2) con basso (consueto) assunzione di DHA (200 mg/giorno) (Gruppo MO) e donne obese pre-gestazionali integrate con una dose elevata di DHA (800 mg/giorno) (Gruppo MO+DHA):

• Analizzare se l'integrazione materna di DHA modifica la composizione corporea nei neonati e nei bambini a 4 mesi di età.
• Determinare se l'integrazione materna con DHA durante la gravidanza modifica l'equilibrio delle citochine pro e antinfiammatorie circolanti e dei marcatori metabolici nella madre durante la gravidanza, nel feto, nella placenta e nel bambino a 4 mesi di età
• Determinare se la risposta dei macrofagi ai mediatori dell'infiammazione si associa a marcatori epigenetici alterati nei geni pro- e anti-infiammatori correlati all'obesità nei monociti fetali di madri obese e se l'integrazione materna di DHA ripristina questo fenotipo.
• Determinare se l'obesità materna si traduce in cambiamenti nel profilo di metilazione del DNA dell'intero genoma nei monociti fetali alla nascita e l'impatto dell'integrazione materna di DHA su questo effetto epigenetico.

METODOLOGIA. Lo studio EpiFat, è una coorte nidificata nel controllo dell'obesità materna attraverso la nutrizione sana, studio MIGHT (PI: Dr. Garmendia NCT02574767). Lo studio MIGHT ha randomizzato 1000 pazienti che hanno iniziato l'assistenza prenatale prima delle 14 settimane di gestazione in uno dei quattro bracci dello studio parallelo: 2 gruppi hanno ricevuto 200 mg/giorno di DHA (basato sull'olio di Schizochytrium, 100% DHA, DSM) e 2 gruppi 800 mg/giorno DHA, ogni gruppo aveva un gruppo con e uno senza interventi di dieta e attività fisica domiciliari.

Reclutamento e follow-up: Al momento del ricovero presso l'unità pre-parto, le ostetriche dell'Ospedale Dr. Sótero del Río invitano tutte le donne in gravidanza che soddisfano i criteri di ammissibilità a partecipare a questo studio e svolgono il processo di consenso informato.

Dopo il reclutamento nello studio EpiFat, al momento del parto, l'ostetrica preleva campioni di sangue cordonale e tessuto placentare. Tra le 24 e le 48 ore. dopo il parto, le pazienti vengono visitate dall'ostetrica ricercatrice per eseguire l'antropometria al neonato e raccogliere dati sociodemografici e informazioni cliniche sulla salute delle donne e sul processo di parto.

A 4 mesi i bambini hanno una visita, nel Centro di ricerca sull'ambiente alimentare e la prevenzione delle malattie croniche associate alla nutrizione (CIAPEC per il suo acronimo spagnolo) dell'Istituto di nutrizione e tecnologia alimentare (INTA per il suo acronimo spagnolo), per valutare l'antropometria e composizione corporea. In questa visita vengono raccolti campioni di sangue infantile (5 ml.) e informazioni sullo stato di salute del neonato. Inoltre, viene eseguita l'antropometria materna e vengono applicate alla madre indagini sull'alimentazione infantile e sulla frequenza degli alimenti.

Misura di prova:

Per calcolare la dimensione del campione per la percentuale di grasso corporeo (outcome primario) sono state considerate una differenza media del 2,5% e 3,0 SD descritte da Catalano. Considerando una potenza dell'80% e un valore p di 0,05, la stima della dimensione del campione era di 45 soggetti per gruppo. Il calcolo è stato effettuato utilizzando il software Statistics/Data Analysis STATA versione 14.0 (Texas, USA). Considerando un 20% di perdita al follow-up, la dimensione del campione è stata adattata a 54 soggetti per gruppo.

Per l'esito secondario "la risposta infiammatoria guidata dall'epigenetica dei macrofagi neonatali in vitro" non ci sono prove pubblicate. Tuttavia, studi precedenti del nostro gruppo hanno dimostrato che: Per % di metilazione nel promotore IL-1β, una dimensione del campione di 15 neonati per gruppo da madre di peso normale e obesa era sufficiente per trovare una differenza statistica tra i gruppi, e per IL -10 nei macrofagi derivati ​​da monociti neonatali erano necessari 10 soggetti per gruppo. Pertanto, per questi risultati è stata considerata una dimensione del campione di 15 soggetti per gruppo.

LE VARIABILI NEONATI E MATERNE DELLO STUDIO.

Le variabili incluse nello studio sono:

• Variabili di neonati/lattanti: % di grasso corporeo e risposta infiammatoria guidata dall'epigenetica nei macrofagi neonatali.
• Variabili indipendenti delle madri durante la gravidanza (settimana 14 e 24-28 di gravidanza): età materna (anni), BMI (kg/m2, classificazione), peso (kg), altezza (m), età gestazionale (settimana + giorni) , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), trigliceridi, colesterolo, colesterolo LDL, VLDL, HDL (tutti in mg/dl), glicemia a digiuno (mg/dL) e insulina (pg/mL), HOMA-IR, adiponectina (ug/mL), livelli plasmatici di DHA (μmol/l).
• Variabili indipendenti della madre alla nascita: incremento ponderale gestazionale (kg, classificazione), tipo di parto, ore di travaglio.
• Variabili indipendenti del neonato: sesso, età (settimane alla nascita, settimane postnatali), peso (g), lunghezza (cm), circonferenza cranica (cm), indice ponderale (kg/m3), peso per età gestazionale (classificazione), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), livelli plasmatici di DHA (μmol/l), pliche cutanee (mm) (bicipiti, tricipiti, sottoscapolare, soprailiaco e stretto).
• Altre variabili materne: parità, abitudine al fumo, istruzione (anni), tipo di parto, peso placentare (g).

EX VIVO E IN VITRO STUDIA IL SANGUE DEL CORDONE OMBELICALE. Il sangue del cordone ombelicale viene raccolto dopo il parto e prima dell'espulsione placentare in sacche di raccolta del sangue Terumo (40-100 ml) e conservato a 4°C fino alla lavorazione (entro 1-5 ore dopo il parto).

LIVELLI DI DHA NEL SANGUE MATERNO E FETALE: Questi saranno misurati nello studio MIGHT mediante gasscromatografia.

ISOLAMENTO DEI MONOCITI, COLTURA CELLULARE E DIFFERENZIAMENTO DEI MACROFAGI. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) vengono separate poco dopo la nascita dal gradiente di densità di Ficoll utilizzando la centrifugazione Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) e incubate in terreno RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) e seminate a densità di Da 8 a 10 × 106 cellule/mL in piastre di coltura da 100 mm al 5% di CO2 per 2 ore a 37°C. L'identità dei monociti viene valutata mediante citometria a flusso. I monociti vengono coltivati ​​per 7 giorni per valutare la differenziazione dei macrofagi. La polarizzazione dei macrofagi viene indotta esponendo per 24 ore a 100 ng/mL di LPS (SigmaAldrich, Missouri, US) e 20 ng/mL di INFγ (R&D Systems, Minneapolis, US) per M1 o, in alternativa, a 20 ng/mL di IL-4 (sistemi di ricerca e sviluppo, Minneapolis, Stati Uniti) per M2 in mezzo RPMI integrato con FBS al 5%.

Le cellule vengono seminate su piastre di coltura in plastica e mantenute in un incubatore ad atmosfera controllata, a 37°C con diverse condizioni sperimentali.

QUANTIFICAZIONE DI CITOCHINE PRO E ANTIINFIAMMATORIE, INSULINA, LEPTIN E ADIPONECTINA NEL PLASMA MATERNO, NEONATALE E INFANTILE.

Questi mediatori pro e antinfiammatori, leptina e insulina sono quantificati utilizzando un test immunometrico multiplex (piattaforma Bio-Plex) (MILLIPLEX xMAP High Sensitivity Human Cytokine Panel e pannello metabolico umano, Millipore, Billerica, MA, USA). La quantificazione dell'adiponectina totale nel plasma del cordone ombelicale viene eseguita con il kit ELISA ad alto peso molecolare e adiponectina totale (ALPCO), secondo le istruzioni del produttore.

PREPARAZIONE DI OMOGENATI PLACENTALI. Le placente vengono raccolte al momento del parto e pesate dopo il taglio del cordone e delle membrane, immediatamente poste in ghiaccio dopo il parto e sezionate. La placca corionica, il sacco amniotico e la decidua rimossi. Circa 50 g di tessuto villoso vengono tagliati in piccoli pezzi e lavati con soluzione fisiologica ghiacciata. Il tessuto sarà posto in tampone D ghiacciato [250 mM saccarosio, 0.7 μM pepstatina A, 1.6 μM antidolorifico, 80 μM aprotinina, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-Tris (pH 7.4)] a 4°C e omogeneizzato su ghiaccio utilizzando un politrone. L'omogenato viene congelato a scatto in azoto liquido e conservato a -80°C fino all'analisi o all'ulteriore lavorazione.

PCR QUANTITATIVA PER L'ESPRESSIONE IN VITRO DI CITOCHINE. L'RNA viene isolato dai monociti utilizzando un kit commerciale (GenElute, Sigma), secondo le istruzioni del produttore. RT viene eseguito con ImProm-II Reverse.

Sistema di trascrizione (Promega). La PCR viene eseguita utilizzando primer oligonucleotidici per TNFα umano, IL-6, Il-1β, MCP-1 e IL-10. I livelli di mRNA per GADPH, ATP5F1 e RPLP2 sono usati come riferimenti interni. I primer sono convalidati per l'uso: verifica dell'amplificazione, delle concentrazioni dei primer, dell'efficienza dei primer-HK e della stabilità di HK in condizioni sperimentali. L'espressione relativa dei geni bersaglio viene calcolata utilizzando il metodo 2-delta delta ct.

CITOMETRIA A FLUSSO PER LA CARATTERIZZAZIONE DEI MONOCITI. L'espressione di diversi marcatori di superficie viene valutata utilizzando la citometria a flusso, che viene eseguita su sangue intero per l'identificazione di sottotipi di monociti o macrofagi differenziati in vitro per l'identificazione dell'immunofenotipo. Tra i monociti circolanti (cellule CD86+) i sottotipi classici e non classici sono valutati in base alla loro espressione superficiale di CD14 e CD16.

Immunofenotipo dei macrofagi (es. M1 e ​​M2) sono valutati in base all'espressione di marcatori specifici (es. CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFα, NESSUNA produzione). I campioni vengono colorati in laboratorio e inviati a una struttura di citometria a flusso presso l'Universidad de Chile (analizzatore CyAnTM ADP (Beckman Coulter®), entro 48 ore.

DNA METILOMICO GLOBALE. L'analisi del DNA Methylome viene eseguita in collaborazione con il Dr. Graham Burdge e la Dr.ssa Karen Lillycrop di Southampton utilizzando il kit Infinium Methylation EPIC BeadChip di Illumina.

ANALISI DELLA METILAZIONE DEL DNA. Lo stato di metilazione del DNA delle regioni del promotore (circa 400 bp dal sito di inizio della trascrizione) dei geni che codificano per TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARγ e PCG1α sarà determinato utilizzando bisolfito modifica accoppiata al sequenziamento del DNA. In breve, gli estratti di DNA totale dalle cellule saranno trattati con bisolfito di sodio per convertire la citosina non metilata in uracile, e le regioni del promotore saranno amplificate mediante PCR utilizzando specifiche secondo la strategia utilizzata e pubblicata dal nostro gruppo. In breve, uno dei primer PCR sarà progettato includendo un tag 5'-biotina, che consentirà la purificazione dell'amplicone direttamente dalla miscela PCR. Quindi il filamento di DNA amplificato contenente biotina verrà trasferito a un pirosequenziatore PyroMark Q96 MD (Qiagen) per il sequenziamento. Le metilazioni CpG sito-specifiche saranno determinate come percentuale, confrontando l'intensità del segnale di CpG non bisolfito-sensibile (C conservato, CpG metilato) e CpG bisolfito-sensibile (C→T convertito, CpG non metilato).

ANALISI STATISTICA. Per le statistiche descrittive si applicherà la media ± SD o mediana e l'intervallo interquartile per le variabili quantitative e la percentuale con n per le categorie. Le distribuzioni saranno verificate con un test di Shapiro Wilk. Le differenze nella massa grassa e nei marcatori circolanti saranno determinate mediante ANOVA o Kruskal Wallis in base alla distribuzione dei dati. Verrà applicata la correlazione di Spearman (parametrica) o di Pearson (non parametrica) per determinare l'associazione tra variabili dipendenti e indipendenti (materne e neonatali). Le variabili indipendenti saranno adattate a modelli di regressione logistica e lineare per valutare le interazioni e identificare i fattori confondenti. Per gli studi in vitro, i confronti tra due o più gruppi saranno eseguiti rispettivamente mediante il t-test per unpaired di Student e l'analisi della varianza (ANOVA). Se l'ANOVA dimostra un'interazione significativa tra le variabili, le analisi post hoc sono state eseguite da Dunns durante il confronto di gruppi selezionati e il test di correzione di Bonferroni a confronto multiplo. I dati per le risposte in vitro alle citochine saranno adattati alle curve dose-risposta da cui saranno ottenute la risposta massima e la potenza del farmaco (pD2 = -Log EC50). Il confronto delle curve e delle risposte massime in diverse condizioni sarà analizzato mediante ANOVA. Tutte le analisi saranno effettuate con il software statistico Graphpad Prism, STATA o SPSS considerando un p<0.05 come cut-off per la significatività statistica.