Foetale programmering van immuunrespons en lichaamsvet door maternale obesitas (EpiFat)

DOELEN:

Bij pasgeborenen geboren uit zwangere vrouwen met een normale BMI (> 18,5 en < 24,9) bij het eerste prenatale bezoek (< 14 weken zwangerschap) (referentiegroep) en met pre-zwangerschapsobesitas (BMI > 30 kg/m2) met een lage (gebruikelijke) DHA-inname (200 mg/dag) (MO-groep) en prezwangerschapsobese vrouwen aangevuld met een hoge dosis DHA (800 mg/dag) (MO+DHA-groep) zullen we:

• Analyseer of maternale DHA-suppletie de lichaamssamenstelling verandert bij pasgeborenen en kinderen van 4 maanden oud.
• Bepaal of maternale suppletie met DHA tijdens de zwangerschap de balans van circulerende pro- en ontstekingsremmende cytokines en metabole markers bij de moeder tijdens de zwangerschap, de foetus, de placenta en het kind op de leeftijd van 4 maanden wijzigt
• Bepaal of de respons van macrofagen op inflammatoire mediatoren geassocieerd is met veranderde epigenetische markers in pro- en anti-inflammatoire obesitas-gerelateerde genen in foetale monocyten van zwaarlijvige moeders en of suppletie met DHA door de moeder dit fenotype omkeert.
• Bepaal of maternale obesitas zich vertaalt in veranderingen in het genoombrede DNA-methylatieprofiel in foetale monocyten bij de geboorte en de impact van maternale DHA-suppletie op dit epigenetische effect.

METHODOLOGIE. De EpiFat-studie is een ingebed cohort in de Maternale obesitascontrole door middel van gezonde voeding, MIGHT-studie (PI: Dr. Garmendia NCT02574767). De MIGHT-studie randomiseerde 1000 patiënten die hun prenatale zorg begonnen vóór 14 weken zwangerschap in een van de vier parallelle onderzoeksarmen: 2 groepen kregen 200 mg/dag DHA (gebaseerd op Schizochytrium-olie, 100% DHA, DSM) en 2 groepen 800 mg/dag DHA, elke groep had een groep met en een zonder interventies op het gebied van voeding en lichaamsbeweging thuis.

Werving en follow-up: bij opname in de pre-delivery-afdeling nodigen vroedvrouwen van het Dr. Sótero del Río-ziekenhuis alle zwangere vrouwen die voldoen aan de geschiktheidscriteria uit om deel te nemen aan dit onderzoek en voeren ze een proces van geïnformeerde toestemming uit.

Na werving in de EpiFat-studie neemt de vroedvrouw op het moment van bevalling navelstrengbloedmonsters en het placentaweefsel af. Tussen 24 en 48 uur. na de bevalling worden patiënten bezocht door de onderzoeksvroedvrouw om antropometrie uit te voeren bij de pasgeborene en sociodemografische gegevens en klinische informatie te verzamelen over de gezondheid van vrouwen en het bevallingsproces.

Na 4 maanden krijgen de baby's een bezoek aan het Research Center in Eating Environment and Prevention of Associated to Nutrition Chronic Diseases (CIAPEC voor zijn Spaanse acroniem) van het Institute of Nutrition and Food Technology (INTA voor zijn Spaanse acroniem), om antropometrie te evalueren en lichaamssamenstelling. Tijdens dit bezoek worden bloedmonsters van baby's (5 ml) en informatie over de gezondheidsstatus van baby's verzameld. Verder wordt maternale antropometrie uitgevoerd en worden babyvoeding en voedselfrequentie-onderzoeken toegepast op de moeder.

Steekproefgrootte:

Om de steekproefgrootte voor lichaamsvetpercentage (primaire uitkomst) te berekenen, werd een gemiddeld verschil van 2,5% en 3,0 SD beschouwd, zoals beschreven door Catalano. Uitgaande van een vermogen van 80% en een p-waarde van 0,05, was de schatting van de steekproefomvang 45 proefpersonen per groep. De berekening is gemaakt met behulp van de software Statistics/Data Analysis STATA versie 14.0 (Texas, VS). Rekening houdend met een verlies van 20% voor follow-up, werd de steekproefomvang aangepast tot 54 proefpersonen per groep.

Voor de secundaire uitkomst "de door epigenetica aangedreven ontstekingsreactie van neonatale macrofagen in vitro" is geen bewijs gepubliceerd. Eerdere studies van onze groep hebben echter aangetoond dat: voor % methylering in de IL-1β-promotor was een steekproefomvang van 15 pasgeborenen per groep van normaal gewicht en zwaarlijvige moeder voldoende om een ​​statistisch verschil tussen de groepen te vinden, en voor IL -10 in macrofagen afgeleid van neonatale monocyten waren 10 proefpersonen per groep nodig. Daarom werd voor deze uitkomsten een steekproefomvang van 15 proefpersonen per groep beschouwd.

PASGEBOREN EN MOEDELIJKE VARIABELLEN VAN DE STUDIE.

De variabelen die in het onderzoek zijn meegenomen zijn:

• Variabelen van pasgeborenen/zuigelingen: % lichaamsvet & epigenetisch aangedreven ontstekingsreactie in neonatale macrofagen.
• Onafhankelijke variabelen van de moeders tijdens de zwangerschap (week 14 en 24-28 van de zwangerschap): leeftijd van de moeder (jaren), BMI (kg/m2, classificatie), gewicht (kg), lengte (m), zwangerschapsduur (week + dagen) , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), triglyceriden, cholesterol, LDL-cholesterol, VLDL, HDL (allemaal in mg/dl), nuchtere glykemie (mg/dL) en insuline (pg/ml), HOMA-IR, adiponectine (ug/ml), plasmaspiegels van DHA (μmol/l).
• Onafhankelijke variabelen van de moeder bij de geboorte: gewichtstoename tijdens de zwangerschap (kg, classificatie), type bevalling, aantal uren bevalling.
• Onafhankelijke variabelen van de pasgeborene: geslacht, leeftijd (weken bij geboorte, postnatale weken), gewicht (g), lengte (cm), hoofdomtrek (cm), ponderale index (kg/m3), gewicht voor zwangerschapsduur (classificatie), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/ml), plasmaspiegels van DHA (μmol/l), huidplooien (mm) (biceps, triceps, subscapulair, suprailiacaal en strak).
• Andere maternale variabelen: pariteit, rookgewoonte, opleiding (jaren), type bevalling, gewicht van de placenta (g).

EX VIVO & IN VITRO STUDIES NAVELSTRENGBLOED. Na de bevalling en vóór de placenta-uitdrijving wordt navelstrengbloed afgenomen in Terumo-bloedverzamelzakken (40-100 ml) en tot verwerking bewaard bij 4°C (binnen 1-5 uur na de bevalling).

DHA-NIVEAUS IN BLOED VAN MOEDER EN FOETAAL: Deze worden gemeten in MIGHT Study door middel van gaschromatografie.

MONOCYTENISOLATIE, CELCULTUUR EN MACROFAGENDIFFERENTIATIE. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) worden kort na de geboorte gescheiden door Ficoll-dichtheidsgradiënt met behulp van Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Missouri, VS) centrifugatie en geïncubeerd in RPMI 1640-medium (Sigma-Aldrich, Missouri, VS) en gezaaid met een dichtheid van 8 tot 10 × 106 cellen/ml in kweekschalen van 100 mm bij 5% CO2 gedurende 2 uur bij 37 °C. De identiteit van monocyten wordt beoordeeld door middel van flowcytometrie. Monocyten worden gedurende 7 dagen gekweekt om macrofaagdifferentiatie te beoordelen. Macrofaagpolarisatie wordt geïnduceerd door blootstelling gedurende 24 uur aan 100 ng/ml LPS (SigmaAldrich, Missouri, VS) en 20 ng/ml INFγ (R&D Systems, Minneapolis, VS) voor M1 of, als alternatief, aan 20 ng/ml IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, VS) voor M2 in RPMI-medium aangevuld met 5% FBS.

Cellen worden gezaaid op plastic kweekschalen en bewaard in een incubator met gecontroleerde atmosfeer, bij 37°C met verschillende experimentele omstandigheden.

KWANTIFICATIE VAN PRO- EN ANTI-INFLAMMATISCHE CYTOKINES, INSULINE, LEPTINE & ADIPONECTINE IN MATERNAAL, NEONATAAL EN ZUIGELPLASMA.

Deze pro- en ontstekingsremmende mediatoren, leptine en insuline, worden gekwantificeerd met behulp van een gemultiplexte (Bio-Plex-platform) immunometrische test (MILLIPLEX xMAP High Sensitivity Human Cytokine Panel en humaan metabolisch panel, Millipore, Billerica, MA, VS). Kwantificering van totaal adiponectine in navelstrengplasma wordt gedaan met High Molecular Weight & Total Adiponectin (ALPCO) ELISA-kit, volgens de instructies van de fabrikant.

BEREIDING VAN PLACENTALE HOMOGENATEN. Placenta's worden bij aflevering verzameld en gewogen na het trimmen van de streng en membranen, onmiddellijk na aflevering op ijs geplaatst en ontleed. De chorionplaat, vruchtzak en decidua verwijderd. Ongeveer 50 g villous weefsel wordt in kleine stukjes gesneden en gespoeld met ijskoude fysiologische zoutoplossing. Weefsel wordt in ijskoude buffer D geplaatst [250 mM sucrose, 0,7 μM pepstatine A, 1,6 μM antipijn, 80 μM aprotinine, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-Tris (pH 7,4)] bij 4°C en gehomogeniseerd op ijs behulp van een polytron. Het homogenaat wordt snel ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80°C tot analyse of verdere verwerking.

KWANTITATIEVE PCR VOOR IN VITRO EXPRESSIE VAN CYTOKINEN. RNA wordt geïsoleerd uit monocyten met behulp van een in de handel verkrijgbare kit (GenElute, Sigma), volgens de instructies van de fabrikant. RT wordt uitgevoerd met de ImProm-II Reverse.

Transcriptiesysteem (Promega). PCR wordt uitgevoerd met behulp van oligonucleotideprimers voor humaan TNFa, IL-6, Il-1β, MCP-1 en IL-10. De niveaus van mRNA's voor GADPH, ATP5F1 en RPLP2 worden gebruikt als interne referenties. Primers zijn gevalideerd voor gebruik: controle van amplificatie, primerconcentraties, efficiëntie primers-HK en stabiliteit van HK in experimentele omstandigheden. Relatieve expressie van doelwitgenen wordt berekend met behulp van de 2-delta delta ct-methode.

STROOMCYTOMETRIE VOOR KENMERKING VAN MONOCYTEN. De expressie van verschillende oppervlaktemarkers wordt geëvalueerd met behulp van flowcytometrie, die wordt uitgevoerd in volbloed voor identificatie van monocyt-subtypen of in vitro gedifferentieerde macrofagen voor identificatie van het immunofenotype. Van de circulerende monocyten (CD86+-cellen) worden klassieke en niet-klassieke subtypes beoordeeld op basis van hun oppervlakte-expressie van CD14 en CD16.

Immunofenotype van macrofagen (d.w.z. M1 en M2) worden beoordeeld op basis van de uitdrukking van specifieke markers (bijv. CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFα, GEEN productie). Monsters worden gekleurd in het laboratorium en binnen 48 uur verzonden naar een Flow Cytometry Facility aan de Universidad de Chile (CyAnTM ADP-analysator (Beckman Coulter®).

GLOBAAL DNA-METHYLOOM. De DNA Methylome-analyse wordt uitgevoerd in samenwerking met Dr. Graham Burdge en Dr. Karen Lillycrop uit Southampton met behulp van de Infinium Methylation EPIC BeadChip-kit van Illumina.

DNA-METHYLATIE-ANALYSE. De DNA-methyleringsstatus van de promotorregio's (ongeveer 400 bp van de startplaats van de transcriptie) van de genen die coderen voor TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARy en PCG1α zal worden bepaald met behulp van bisulfiet modificatie gekoppeld aan DNA-sequencing. In het kort, totale DNA-extracten van cellen zullen worden behandeld met natriumbisulfiet om niet-gemethyleerd cytosine om te zetten in uracil, en promotorregio's zullen worden geamplificeerd door PCR met behulp van specifieke volgens de strategie die door onze groep wordt gebruikt en gepubliceerd. In het kort zal één van de PCR-primers worden ontworpen met inbegrip van een 5'-biotine-tag, waarmee het amplicon rechtstreeks uit het PCR-mengsel kan worden gezuiverd. Vervolgens wordt de biotine-bevattende geamplificeerde DNA-streng overgebracht naar een PyroMark Q96 MD-pyrosequencer (Qiagen) voor sequentiebepaling. Plaatsspecifieke CpG-methyleringen zullen worden bepaald als percentage, waarbij de signaalintensiteit van niet-bisulfietgevoelig CpG (geconserveerd C, gemethyleerd CpG) en bisulfietgevoelig CpG (geconverteerd C→T, niet-gemethyleerd CpG) wordt vergeleken.

STATISTISCHE ANALYSE. Voor beschrijvende statistiek wordt het gemiddelde ± SD of mediaan en interkwartielbereik toegepast voor kwantitatieve variabelen, en percentage met n voor categorieën. Uitkeringen worden geverifieerd met een Shapiro Wilk-test. Verschillen in vetmassa en circulerende markers worden bepaald door ANOVA of Kruskal Wallis volgens de gegevensdistributie. Spearman (parametrische) of Pearson (geen parametrische) correlatie zal worden toegepast om de associatie tussen afhankelijke en onafhankelijke (maternale en neonatale) variabelen te bepalen. Onafhankelijke variabelen zullen worden aangepast aan logistische en lineaire regressiemodellen om interacties te evalueren en verstorende factoren te identificeren. Voor in vitro studies zullen vergelijkingen tussen twee of meer groepen uitgevoerd worden door middel van respectievelijk Student's ongepaarde t-test en variantieanalyse (ANOVA). Als de ANOVA een significante interactie tussen variabelen aantoont, werden post-hocanalyses uitgevoerd door Dunns bij het vergelijken van geselecteerde groepen en Bonferroni-correctietest met meerdere vergelijkingen. Gegevens voor in vitro reacties op cytokines zullen worden aangepast aan dosis-responscurven waaruit maximale respons en geneesmiddelpotentie (pD2 = -Log EC50) zullen worden verkregen. Vergelijking van curves en maximale respons onder verschillende omstandigheden zal worden geanalyseerd door middel van ANOVA. Alle analyses worden uitgevoerd met de statistische software Graphpad Prism, STATA of SPSS, waarbij een p<0,05 wordt beschouwd als grenswaarde voor statistische significantie.