Фетальное программирование иммунного ответа и жировых отложений при материнском ожирении (EpiFat)

ЦЕЛИ:

У новорожденных, рожденных от беременных с нормальным ИМТ (>18,5 и <24,9) при первом пренатальном визите (<14 недель гестации) (контрольная группа) и с прегестационным ожирением (ИМТ>30 кг/м2) с низким (обычное) потребление DHA (200 мг/день) (группа MO) и женщины с ожирением до беременности, получающие высокие дозы DHA (800 мг/день) (группа MO+DHA), мы будем:

• Проанализируйте, изменяет ли материнская добавка ДГК состав тела у новорожденных и детей в возрасте 4 месяцев.
• Определите, изменяет ли прием матерью ДГК во время беременности баланс циркулирующих про- и противовоспалительных цитокинов и метаболических маркеров у матери во время беременности, плода, плаценты и ребенка в возрасте 4 месяцев.
• Определите, связана ли реакция макрофагов на медиаторы воспаления с измененными эпигенетическими маркерами в про- и противовоспалительных генах, связанных с ожирением, в фетальных моноцитах матерей с ожирением, и восстанавливает ли этот фенотип добавление ДГК к матерям.
• Определите, приводит ли материнское ожирение к изменениям в профиле метилирования ДНК всего генома в моноцитах плода при рождении, а также влияние материнской добавки DHA на этот эпигенетический эффект.

МЕТОДОЛОГИЯ. Исследование EpiFat представляет собой вложенную когорту в исследование «Контроль материнского ожирения с помощью здорового питания, MIGHT» (PI: Dr. Garmendia NCT02574767). В исследовании MIGHT 1000 пациенток, которые начали пренатальный уход до 14 недель беременности, были рандомизированы в одну из четырех параллельных групп исследования: 2 группы получали 200 мг/день ДГК (на основе масла Schizochytrium, 100% ДГК, DSM) и 2 группы 800 мг/день. DHA, в каждой группе была группа с домашним питанием и физической активностью и одна без них.

Набор и последующее наблюдение: при поступлении в предродовое отделение акушерки больницы доктора Сотеро дель Рио приглашают всех беременных женщин, отвечающих критериям приемлемости, для участия в этом исследовании и проводят процесс получения информированного согласия.

После включения в исследование EpiFat во время родов акушерка собирает образцы пуповинной крови и ткани плаценты. От 24 до 48 часов. после родов пациенток посещает акушерка-исследователь для проведения антропометрии новорожденного и сбора социально-демографических данных и клинической информации о здоровье женщины и процессе родов.

В возрасте 4 месяцев младенцы посещают Исследовательский центр пищевой среды и профилактики хронических заболеваний, связанных с питанием (CIAPEC для его испанской аббревиатуры) Института питания и пищевых технологий (INTA для его испанской аббревиатуры), для оценки антропометрии. и состав тела. Во время этого визита берутся образцы крови младенцев (5 мл) и информация о состоянии здоровья младенцев. Кроме того, проводится антропометрия матери, а также проводятся обследования кормления младенцев и частоты питания матери.

Размер образца:

Для расчета размера выборки по процентному содержанию телесного жира (первичный результат) учитывали среднюю разницу в 2,5% и 3,0 SD, которые были описаны Catalano. Учитывая мощность 80% и значение p 0,05, оценка размера выборки составила 45 человек на группу. Расчет выполнен с использованием программного обеспечения Statistics/Data Analysis STATA версии 14.0 (Техас, США). Учитывая 20% выбывших из числа участников, размер выборки был скорректирован до 54 человек на группу.

Для вторичного исхода «эпигенетически обусловленный воспалительный ответ неонатальных макрофагов in vitro» нет опубликованных доказательств. Тем не менее, предыдущие исследования нашей группы показали, что: Для % метилирования в промоторе IL-1β размера выборки в 15 новорожденных в группе от матерей с нормальным весом и с ожирением было достаточно, чтобы найти статистическую разницу между группами, а для IL -10 в макрофагах, полученных из неонатальных моноцитов, требовалось 10 субъектов на группу. Таким образом, для этих результатов считалось, что размер выборки составляет 15 субъектов на группу.

НОВОРОЖДЕННЫЕ И МАТЕРИНСКИЕ ПЕРЕМЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Переменные, включенные в исследование:

• Переменные новорожденных/младенцев: % телесного жира и эпигенетически обусловленная воспалительная реакция в неонатальных макрофагах.
• Независимые переменные матери во время беременности (14 и 24-28 неделя беременности): возраст матери (лет), ИМТ (кг/м2, классификация), масса тела (кг), рост (м), срок беременности (неделя + дни). , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (пг/мл), триглицериды, холестерин, холестерин ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП (все в мг/дл), гликемия натощак (мг/дл) и инсулин (пг/мл), HOMA-IR, адипонектин (мкг/мл), уровни ДГК в плазме (мкмоль/л).
• Независимые переменные матери при рождении: гестационная прибавка массы тела (кг, классификация), вид родов, продолжительность родов.
• Независимые переменные новорожденного: пол, возраст (недели при рождении, постнатальные недели), масса тела (г), длина тела (см), окружность головы (см), массовый индекс (кг/м3), масса тела по гестационному возрасту (классификация), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (пг/мл), уровни ДГК в плазме (мкмоль/л), кожные складки (мм) (бицепс, трицепс, подлопаточная, надподвздошная и плотная).
• Другие материнские переменные: паритет, привычка курить, образование (годы), тип родов, масса плаценты (г).

EX VIVO И IN VITRO ИССЛЕДОВАНИЯ ПУПОНОВОЙ КРОВИ. Пуповинную кровь собирают после родов и перед изгнанием плаценты в пакеты для сбора крови Terumo (40-100 мл) и хранят при 4°С до обработки (в течение 1-5 часов после родов).

УРОВНИ ДГК В КРОВИ МАТЕРИ И ПЛОДА: они будут измерены в исследовании MIGHT с помощью газовой хроматографии.

ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОЦИТОВ, КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ МАКРОФАГОВ. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) отделяют вскоре после рождения в градиенте плотности Фиколла с использованием центрифугирования Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Миссури, США) и инкубируют в среде RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Миссури, США) и высевают при плотности От 8 до 10 × 106 клеток/мл в культуральных чашках диаметром 100 мм при 5% СО2 в течение 2 ч при 37°С. Идентичность моноцитов оценивают с помощью проточной цитометрии. Моноциты культивируют в течение 7 дней для оценки дифференцировки макрофагов. Поляризацию макрофагов индуцируют воздействием в течение 24 часов 100 нг/мл LPS (SigmaAldrich, Миссури, США) и 20 нг/мл INFγ (R&D Systems, Миннеаполис, США) для M1 или, альтернативно, 20 нг/мл IL-4 (R&D Systems, Миннеаполис, США) для M2 в среде RPMI с добавлением 5% FBS.

Клетки высевают на пластиковые чашки для культивирования и выдерживают в инкубаторе с контролируемой атмосферой при 37°C с различными экспериментальными условиями.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРО- И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, ИНСУЛИНА, ЛЕПТИНА И АДИПОНЕКТИНА В ПЛАЗМЕ МАТЕРИ, НОВОРОЖДЕННЫХ И РЕБЕНКА.

Эти про- и противовоспалительные медиаторы, лептин и инсулин количественно оценивают с помощью мультиплексного (платформа Bio-Plex) иммунометрического анализа (панель MILLIPLEX xMAP High Sensitivity Human Cytokine Panel и панель метаболизма человека, Millipore, Billerica, MA, USA). Количественное определение общего адипонектина в плазме пуповины проводят с помощью набора для высокомолекулярного и общего адипонектина (ALPCO) ELISA в соответствии с инструкциями производителя.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГОМОГЕНАТОВ ПЛАЦЕНТЫ. Плаценты собирают при родах и взвешивают после обрезки пуповины и оболочек, сразу после родов помещают на лед и препарируют. Хориальная пластинка, амниотический мешок и децидуальная оболочка удалены. Приблизительно 50 г ворсинчатой ​​ткани разрезают на мелкие кусочки и промывают ледяным физиологическим раствором. Ткань помещают в ледяной буфер D [250 мМ сахарозы, 0,7 мкМ пепстатина А, 1,6 мкМ антипаина, 80 мкМ апротинина, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES-Tris (pH 7,4)] при 4°C и гомогенизируют на льду. с помощью политрона. Гомогенат быстро замораживают в жидком азоте и хранят при -80°С до анализа или дальнейшей обработки.

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ПЦР ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЦИТОКИНОВ IN VITRO. РНК выделяют из моноцитов с помощью коммерческого набора (GenElute, Sigma) в соответствии с инструкциями производителя. RT работает с ImProm-II Reverse.

Система транскрипции (Promega). ПЦР проводят с использованием олигонуклеотидных праймеров для человеческого TNFα, IL-6, IL-1β, MCP-1 и IL-10. Уровни мРНК для GADPH, ATP5F1 и RPLP2 используются в качестве внутренних стандартов. Праймеры валидированы для использования: проверка амплификации, концентрации праймеров, эффективности праймеров-ГК и стабильности ГК в экспериментальных условиях. Относительную экспрессию генов-мишеней рассчитывают с использованием метода 2-дельта-дельта-КТ.

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ ДЛЯ ХАРАКТЕРИЗАЦИИ МОНОЦИТОВ. Экспрессию различных поверхностных маркеров оценивают с помощью проточной цитометрии, которую проводят либо в цельной крови для идентификации подтипов моноцитов, либо в дифференцированных in vitro макрофагах для идентификации иммунофенотипа. Среди циркулирующих моноцитов (клетки CD86+) классические и неклассические подтипы оценивают по их поверхностной экспрессии CD14 и CD16.

Иммунофенотип макрофагов (т.е. M1 и M2) оценивают по экспрессии специфических маркеров (например, CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFα, продукция NO). Образцы окрашиваются в лаборатории и отправляются в центр проточной цитометрии Чилийского университета (анализатор АДФ CyAnTM (Beckman Coulter®) в течение 48 часов.

ГЛОБАЛЬНАЯ ДНК МЕТИЛОМ. Метиломный анализ ДНК проводится в сотрудничестве с доктором Грэмом Берджем и доктором Карен Лилликроп из Саутгемптона с использованием набора Infinium Methylation EPIC BeadChip от Illumina.

АНАЛИЗ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК. Статус метилирования ДНК промоторных областей (примерно 400 п.н. от места начала транскрипции) генов, кодирующих TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARγ и PCG1α, будет определяться с использованием бисульфита. модификация, связанная с секвенированием ДНК. Вкратце, экстракты тотальной ДНК из клеток будут обработаны бисульфитом натрия для превращения неметилированного цитозина в урацил, а промоторные области будут амплифицированы с помощью ПЦР с использованием специфической стратегии, используемой и опубликованной нашей группой. Вкратце, один из праймеров для ПЦР будет включать в себя 5'-биотиновую метку, которая позволит очищать ампликон непосредственно из смеси для ПЦР. Затем амплифицированную цепь ДНК, содержащую биотин, переносят в пиросеквенатор PyroMark Q96 MD (Qiagen) для секвенирования. Сайт-специфическое метилирование CpG будет определяться в процентах при сравнении интенсивности сигнала нечувствительного к бисульфиту CpG (консервативный C, метилированный CpG) и чувствительного к бисульфиту CpG (преобразованный C→T, неметилированный CpG).

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. Для описательной статистики будет применяться среднее ± стандартное отклонение или медиана и межквартильный размах для количественных переменных и процент с n для категорий. Распределения будут проверяться тестом Шапиро Уилка. Различия в жировой массе и циркулирующих маркерах будут определяться с помощью ANOVA или Краскела-Уоллиса в соответствии с распределением данных. Для определения связи между зависимыми и независимыми (материнскими и неонатальными) переменными будет применяться корреляция Спирмена (параметрическая) или Пирсона (без параметрическая). Независимые переменные будут подогнаны к моделям логистической и линейной регрессии для оценки взаимодействий, а также для выявления искажающих факторов. Для исследований in vitro сравнения между двумя или более группами будут выполняться с помощью непарного t-критерия Стьюдента и дисперсионного анализа (ANOVA) соответственно. Если дисперсионный анализ демонстрирует значительное взаимодействие между переменными, Даннс проводил апостериорный анализ при сравнении выбранных групп и поправочном тесте Бонферрони для множественного сравнения. Данные об ответах на цитокины in vitro будут сопоставлены с кривыми доза-ответ, из которых будут получены максимальный ответ и эффективность лекарственного средства (pD2 = -Log EC50). Сравнение кривых и максимальных ответов в различных условиях будет проанализировано с помощью ANOVA. Все анализы будут выполняться с помощью статистического программного обеспечения Graphpad Prism, STATA или SPSS с учетом p<0,05 в качестве порога статистической значимости.