Sikiön immuunivasteen ja kehon rasvan ohjelmointi äidin liikalihavuuden mukaan (EpiFat)

TAVOITTEET:

Vastasyntyneillä, jotka ovat syntyneet raskaana olevilta naisilta, joiden BMI on normaali (> 18,5 ja < 24,9) ensimmäisellä synnytystä edeltävällä käynnillä (<14 raskausviikkoa) (vertailuryhmä) ja joilla on raskausta edeltävä liikalihavuus (BMI > 30 kg/m2) ja matala (tavallinen) DHA:n saanti (200 mg/vrk) (MO-ryhmä) ja pre-raskausaikaiset lihavat naiset, joihin on lisätty suuri annos DHA:ta (800 mg/vrk) (MO+DHA-ryhmä)

• Analysoi, muuttaako äidin DHA-lisä vastasyntyneiden ja 4 kuukauden ikäisten lasten kehon koostumusta.
• Selvitä, muuttaako äidin DHA-lisä raskauden aikana kiertävien pro- ja anti-inflammatoristen sytokiinien ja metabolisten merkkiaineiden tasapainoa äidissä raskauden aikana, sikiössä, istukassa ja lapsessa 4 kuukauden iässä
• Selvitä, liittyykö makrofagien vaste tulehdusvälittäjiin muuttuneisiin epigeneettisiin markkereihin liikalihavuuteen liittyvissä pro- ja anti-inflammatorisissa geeneissä lihavien äitien sikiön monosyyteissä ja palauttaako äidin DHA-lisä tämän fenotyypin.
• Selvitä, muuttuuko äidin liikalihavuus muutoksiksi genominlaajuisessa DNA-metylaatioprofiilissa sikiön monosyyteissä syntymähetkellä ja äidin DHA-lisän vaikutukseksi tähän epigeneettiseen vaikutukseen.

METODOLOGIA. EpiFat-tutkimus on sisäkkäinen kohortti Äidin liikalihavuuden hallinta ThrouGh Healthy NuTrition, MIGHT -tutkimuksessa (PI: Dr. Garmendia NCT02574767). MIGHT-tutkimuksessa satunnaistettiin 1000 potilasta, jotka aloittivat synnytyshoidon ennen 14 raskausviikkoa, yhteen neljästä rinnakkaisesta tutkimusryhmästä: 2 ryhmää sai 200 mg/vrk DHA:ta (perustuu Schizochytrium-öljyyn, 100 % DHA, DSM) ja 2 ryhmää 800 mg/vrk. DHA:ta, jokaisessa ryhmässä oli ryhmä, joka sisälsi ja yksi ilman kotipohjaista ruokavaliota ja fyysistä aktiivisuutta.

Rekrytointi ja seuranta: Tohtori Sótero del Ríon sairaalan kätilöt kutsuvat synnytystä edeltävälle osastolle kaikki kelpoisuuskriteerit täyttävät raskaana olevat naiset osallistumaan tähän tutkimukseen ja suorittavat tietoisen suostumusprosessin.

Rekrytoinnin jälkeen EpiFat-tutkimuksessa kätilö kerää synnytyshetkellä napanuoraverinäytteitä ja istukan kudosta. Klo 24-48 välillä. synnytyksen jälkeen tutkijakätilö vierailee potilaiden luona suorittamassa vastasyntyneelle antropometriaa ja keräämässä sosiodemografista tietoa ja kliinistä tietoa naisen terveydestä ja synnytysprosessista.

Neljän kuukauden iässä vauvat vierailevat ravitsemus- ja elintarviketeknologian instituutin syömisympäristön ja ravitsemukseen liittyvien kroonisten sairauksien ehkäisyn tutkimuskeskuksessa (CIAPEC hänen espanjankielisestä lyhenteestään) tutkimassa antropometriaa. ja kehon koostumus. Tällä käynnillä kerätään imeväisten verinäytteitä (5 ml) ja tietoa vauvan terveydentilasta. Lisäksi tehdään äidin antropometriaa sekä imeväisten ruokinta- ja ruokatiheystutkimuksia äidille.

Otoskoko:

Otoskoon laskemiseksi kehon rasvaprosentille (ensisijainen tulos) pidettiin Catalanon kuvaaman keskimääräisen 2,5 prosentin eron ja 3,0 SD:n eron. Ottaen huomioon tehon 80 % ja p-arvon 0,05, otoskoon arvio oli 45 koehenkilöä ryhmää kohden. Laskelma tehtiin Statistics/Data Analysis STATA -ohjelmiston versiolla 14.0 (Texas, USA). Ottaen huomioon 20 %:n menetys seurannassa, otoskoko muutettiin 54 koehenkilöksi ryhmää kohden.

Toissijaisesta tuloksesta "vastasyntyneiden makrofagien epigeneettinen tulehdusvaste in vitro" ei ole julkaistu todisteita. Ryhmämme aikaisemmat tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että: IL-1β-promoottorin metylaatioprosentin kohdalla 15 vastasyntyneen otoskoko normaalipainoisesta ja lihavasta äidistä riitti tilastollisen eron löytämiseksi ryhmien välillä ja IL:lle. -10 vastasyntyneiden monosyyteistä peräisin olevissa makrofageissa Tarvittiin 10 henkilöä ryhmää kohden. Siksi näiden tulosten osalta otoskokona pidettiin 15 henkilöä ryhmää kohden.

TUTKIMUKSEN VASTASYNTYMÄN JA ÄIDÄN MUUTTUJAT.

Tutkimukseen sisältyvät muuttujat ovat:

• Vastasyntyneiden/vauvojen muuttujat: % kehon rasvasta ja epigeneettinen tulehdusvaste vastasyntyneiden makrofageissa.
• Äitien riippumattomat muuttujat raskauden aikana (raskausviikko 14 ja 24-28): äidin ikä (vuosia), BMI (kg/m2, luokitus), paino (kg), pituus (m), raskausaika (viikko + päivät) , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/ml), triglyseridit, kolesteroli, LDL-kolesteroli, VLDL, HDL (kaikki mg/dl), paastoglukemia (mg/dl) ja insuliini (pg/ml), HOMA-IR, adiponektiini (ug/ml), plasman DHA-tasot (μmol/l).
• Äidin riippumattomat muuttujat syntyessään: raskauspainon nousu (kg, luokitus), synnytystapa, synnytystunnit.
• Vastasyntyneen riippumattomat muuttujat: sukupuoli, ikä (syntymäviikot, synnytyksen jälkeiset viikot), paino (g), pituus (cm), pään ympärysmitta (cm), pohjustusindeksi (kg/m3), paino raskausiän mukaan (luokitus), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/ml), DHA:n tasot plasmassa (μmol/l), ihopoimut (mm) (hauislihas, triceps, lapaluun, suprailiac ja tiukka).
• Muut äidin muuttujat: pariteetti, tupakointitapa, koulutus (vuosia), synnytystapa, istukan paino (g).

EX VIVO & IN VITRO TUTKIMUKSET NAPALUUNVERERI. Napanuoraveri kerätään synnytyksen jälkeen ja ennen istukan irtoamista Terumo-verenkeräyspusseihin (40-100 ml) ja säilytetään 4°C:ssa käsittelyyn asti (1-5 tunnin sisällä synnytyksestä).

DHA-TASON ÄIDIN- JA SIKIÖVEREN TASO: Nämä mitataan MIGHT-tutkimuksessa kaasukromatografialla.

MONOSYYTTIEN ERISTÄMINEN, SOLUKULTTUURI JA MAKROFAAGIEN ERILAAMINEN. Perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMC) erotetaan pian syntymän jälkeen Ficoll-tiheysgradientilla käyttämällä Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) sentrifugointia ja inkuboidaan RPMI 1640 -elatusaineessa (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) ja kylvetään tiheydellä. 8 - 10 x 106 solua/ml 100 mm:n viljelymaljoilla 5 % C02:ssa 2 tunnin ajan 37 °C:ssa. Monosyyttien identiteetti määritetään virtaussytometrialla. Monosyyttejä viljellään 7 päivää makrofagien erilaistumisen arvioimiseksi. Makrofagien polarisaatio indusoidaan altistamalla 24 tunnin ajan 100 ng/ml LPS:ää (SigmaAldrich, Missouri, USA) ja 20 ng/ml INFγ:a (R&D Systems, Minneapolis, USA) M1:lle tai vaihtoehtoisesti 20 ng/ml:lle IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, USA) M2:lle RPMI-alustassa, johon on lisätty 5 % FBS:ää.

Solut kylvetään muovisille viljelymaljoille ja niitä pidetään kontrolloidussa ilmakehässä inkubaattorissa 37 °C:ssa erilaisissa koeolosuhteissa.

PRO- JA TULEKSESSA estävien SYTOKIINIEN, INSULIININ, LEPTIININ JA ADIPONEKTIININ MÄÄRÄN MÄÄRITTÄMINEN ÄIDIEN, NEONATALIEN JA SIVULASTEN PLASMASSA.

Nämä pro- ja anti-inflammatoriset välittäjät, leptiini ja insuliini kvantifioidaan käyttämällä multipleksoitua (Bio-Plex-alustan) immunometristä määritystä (MILLIPLEX xMAP High Sensitivity Human Cytokine Panel ja ihmisen metabolinen paneeli, Millipore, Billerica, MA, USA). Napanuoraplasman kokonaisadiponektiinin kvantifiointi tehdään High Molecular Weight & Total Adiponectin (ALPCO) ELISA-sarjalla valmistajan ohjeiden mukaisesti.

ISTIKAHOMOGENAATTIEN VALMISTUS. Istukat kerätään synnytyksen yhteydessä ja punnitaan narun ja kalvojen leikkaamisen jälkeen, asetetaan heti synnytyksen jälkeen jäälle ja leikataan. Korionlevy, lapsivesipussi ja decidua poistettiin. Noin 50 g huokoista kudosta leikataan pieniksi paloiksi ja huuhdellaan jääkylmällä fysiologisella suolaliuoksella. Kudos asetetaan jääkylmään puskuriin D [250 mM sakkaroosia, 0,7 μM pepstatiini A, 1,6 μM antikipua, 80 μM aprotiniinia, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-Tris (pH 7,4)] 4 °C:ssa jäällä. käyttämällä polytronia. Homogenaatti pikapakastetaan nestetypessä ja säilytetään -80°C:ssa analyysiin tai jatkokäsittelyyn asti.

KVANTITATIIVINEN PCR sytokiinien in vitro -ilmentämistä varten. RNA eristetään monosyyteistä käyttämällä kaupallista pakkausta (GenElute, Sigma) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RT suoritetaan ImProm-II Reverse:n kanssa.

Transkriptiojärjestelmä (Promega). PCR suoritetaan käyttämällä oligonukleotidialukkeita ihmisen TNFa:lle, IL-6:lle, IL-1p:lle, MCP-1:lle ja IL-10:lle. GADPH:n, ATP5F1:n ja RPLP2:n mRNA:iden tasoja käytetään sisäisinä vertailuina. Alukkeet on validoitu käytettäväksi: monistuksen, alukepitoisuuksien, tehokkuusalukkeiden-HK:n ja HK:n stabiilisuuden tarkistaminen koeolosuhteissa. Kohdegeenien suhteellinen ilmentyminen lasketaan käyttämällä 2-delta delta ct -menetelmää.

VIRTAUSSYTOMETRIA MONOSYYTTIEN TUNNUSTELUA VARTEN. Erilaisten pintamarkkerien ilmentymistä arvioidaan käyttämällä virtaussytometriaa, joka suoritetaan joko kokoveressä monosyyttialatyyppien tunnistamiseksi tai in vitro erilaistetuissa makrofageissa immunofenotyypin tunnistamiseksi. Verenkierrossa olevien monosyyttien (CD86+-solujen) joukossa klassisia ja ei-klassisia alatyyppejä arvioidaan niiden CD14:n ja CD16:n pintaekspression mukaan.

Makrofagien immunofenotyyppi (esim. M1 ja M2) arvioidaan spesifisten markkerien (esim. CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFa, NO:n tuotanto). Näytteet värjätään laboratoriossa ja lähetetään virtaussytometrialaitokseen Universidad de Chilessä (CyAnTM ADP-analysaattori (Beckman Coulter®) 48 tunnin sisällä.

GLOBAALI DNA-METYLOMI. DNA Methylome -analyysi tehdään yhteistyössä tohtori Graham Burdgen ja tohtori Karen Lillycropin kanssa Southamptonista käyttämällä Illuminan Infinium Methylation EPIC BeadChip -sarjaa.

DNA-METYLAATIOANALYYSI. TNF-α:ta, IL-6:ta, IL-1β:ta, MCP-1:tä, IL-10:tä, PPARy:aa ja PCG1α:aa koodaavien geenien promoottorialueiden (noin 400 emäsparia transkription aloituskohdasta) DNA-metylaatiostatus määritetään käyttämällä bisulfiittia. DNA-sekvensointiin kytketty modifikaatio. Lyhyesti sanottuna solujen kokonais-DNA-uutteet käsitellään natriumbisulfiitilla metyloitumattoman sytosiinin muuntamiseksi urasiiliksi, ja promoottorialueet monistetaan PCR:llä käyttämällä spesifisiä ryhmämme käyttämän ja julkaiseman strategian mukaisesti. Lyhyesti sanottuna yksi PCR-alukkeista suunnitellaan sisältäen 5'-biotiinitunnisteen, joka mahdollistaa amplikonin puhdistamisen suoraan PCR-seoksesta. Sitten biotiinia sisältävä monistettu DNA-juoste siirretään PyroMark Q96 MD pyrosequencer -laitteeseen (Qiagen) sekvensointia varten. Paikkaspesifiset CpG-metylaatiot määritetään prosentteina vertaamalla ei-bisulfiittiherkän CpG:n (konservoitunut C, metyloitu CpG) ja bisulfiittiherkän CpG:n (muuntunut C→T, metyloitumaton CpG) signaalin intensiteettiä.

TILASTOLLINEN ANALYYSI. Kuvaavissa tilastoissa käytetään keskiarvoa ± SD tai mediaania ja kvartiiliväliä kvantitatiivisille muuttujille ja prosenttiosuutta n:llä luokkien osalta. Jakelu varmistetaan Shapiro Wilk -testillä. Rasvamassan ja kiertävien markkerien erot määritetään ANOVA:lla tai Kruskal Wallis -menetelmällä tietojen jakautumisen mukaan. Spearman (parametrinen) tai Pearson (ei parametrista) korrelaatiota käytetään määrittämään riippuvaisten ja riippumattomien (äiti ja vastasyntynyt) muuttujien välinen yhteys. Logistisiin ja lineaalisiin regressiomalleihin sovitetaan riippumattomia muuttujia vuorovaikutusten arvioimiseksi sekä hämmentäviä tekijöitä tunnistamiseksi. In vitro -tutkimuksissa kahden tai useamman ryhmän vertailut suoritetaan Studentin parittoman t-testin ja varianssianalyysin (ANOVA) avulla. Jos ANOVA osoittaa merkittävän vuorovaikutuksen muuttujien välillä, Dunns suoritti post hoc -analyysejä vertaillessaan valittuja ryhmiä ja usean vertailun Bonferroni-korjaustestiä. Tiedot in vitro -vasteista sytokiineille sovitetaan annos-vastekäyriin, joista saadaan maksimaalinen vaste ja lääkkeen teho (pD2 = -Log EC50). Käyrien ja maksimaalisten vasteiden vertailu eri olosuhteissa analysoidaan ANOVA:lla. Kaikki analyysit suoritetaan tilastoohjelmistolla Graphpad Prism, STATA tai SPSS ottaen huomioon p<0,05 tilastollisen merkitsevyyden rajana.