Fosterprogrammering av immunrespons og kroppsfett av mors fedme (EpiFat)

MÅL:

Hos nyfødte født fra gravide kvinner med normal BMI (> 18,5 og <24,9) ved første prenatale besøk (<14 ukers svangerskap) (referansegruppe) og med pre-gestasjonell fedme (BMI >30 Kg/m2) med lav (vanlig) DHA-inntak (200 mg/dag) (MO-gruppe) og pre-gestasjonelle overvektige kvinner supplert med en høy dose DHA (800 mg/dag) (MO+DHA-gruppe) vil vi:

• Analyser om mors DHA-tilskudd endrer kroppssammensetningen hos nyfødte og barn ved 4 måneders alder.
• Finn ut om mors tilskudd med DHA under svangerskapet endrer balansen mellom sirkulerende pro- og antiinflammatoriske cytokiner og metabolske markører hos moren under svangerskapet, fosteret, morkaken og barnet ved 4 måneders alder
• Bestem om responsen til makrofager på inflammatoriske mediatorer assosieres med endrede epigenetiske markører i pro- og anti-inflammatorisk fedtrelaterte gener i fostermonocytter fra overvektige mødre, og om DHA maternell tilskudd reverserer denne fenotypen.
• Bestem om mors fedme oversettes til endringer i den genomomfattende DNA-metyleringsprofilen i fostermonocytter ved fødselen og innvirkningen av mors DHA-tilskudd på denne epigenetiske effekten.

METODOLOGI. EpiFat-studien er en nestet kohort i Maternal Obesity Control ThrouGh Healthy NuTrition, MIGHT-studien (PI: Dr. Garmendia NCT02574767). MIGHT-studien randomiserte 1000 pasienter som begynte sin svangerskapsomsorg før 14 ukers svangerskap til en av fire parallelle studiearmer: 2 grupper fikk 200 mg/dag DHA (basert på Schizochytrium-olje, 100 % DHA, DSM) og 2 grupper 800 mg/dag DHA, hver gruppe hadde en gruppe med og en uten hjemmebasert kosthold og fysisk aktivitetstiltak.

Rekruttering og oppfølging: Ved innleggelse til førfødselsavdelingen inviterer jordmødre ved Dr. Sótero del Río sykehus alle gravide kvinner som oppfyller kvalifikasjonskriteriene til å delta i denne studien og gjennomfører informert samtykkeprosess.

Etter rekruttering i EpiFat-studien, ved leveringstidspunktet, samler jordmor prøver fra navlestrengsblod og morkakevevet. Mellom 24 og 48 timer. etter fødselen besøkes pasientene av forskningsjordmoren for å utføre antropometri til den nyfødte og samle inn sosiodemografiske data og klinisk informasjon om kvinners helse og fødselsprosess.

Ved 4 måneder besøker spedbarnene forskningssenteret for spisemiljø og forebygging av assosierte til ernæringskroniske sykdommer (CIAPEC for hans spanske akronym) fra Institute of Nutrition and Food Technology (INTA for hans spanske akronym), for å evaluere antropometri. og kroppssammensetning. I dette besøket samles spedbarnsblodprøver (5 ml.) og spedbarns helsestatusinformasjon. Videre utføres mødreantropometri, og spedbarnsfôring og matfrekvensundersøkelser brukes til moren.

Eksempelstørrelse:

For å beregne prøvestørrelse for kroppsfettprosent (primært utfall) ble ansett som en gjennomsnittlig forskjell på 2,5 % og 3,0 SD som ble beskrevet av Catalano. Tatt i betraktning en potens på 80 % og p-verdi på 0,05, var prøvestørrelsesestimatet 45 forsøkspersoner per gruppe. Beregningen ble gjort ved hjelp av programvaren Statistics/Data Analysis STATA versjon 14.0 (Texas, USA). Ved å vurdere et tap på 20 % for å følge opp ble prøvestørrelsen justert til 54 forsøkspersoner per gruppe.

For det sekundære resultatet "den epigenetisk-drevne inflammatoriske responsen til neonatale makrofager in vitro" er det ingen bevis publisert. Tidligere studier fra vår gruppe har imidlertid vist at: For % av metylering i IL-1β-promotoren var en prøvestørrelse på 15 nyfødte per gruppe fra normalvektige og overvektige mor nok til å finne en statistisk forskjell mellom gruppene, og for IL -10 i makrofager avledet fra neonatale monocytter var nødvendig med 10 personer per gruppe. For disse resultatene ble det derfor ansett som en utvalgsstørrelse på 15 forsøkspersoner per gruppe.

STUDIENS NYFØDE OG MØDRE VARIABLER.

Variablene som er inkludert i studien er:

• Variabler for nyfødte/spedbarn: % av kroppsfett og epigenetisk drevet inflammatorisk respons i neonatale makrofager.
• Uavhengige variabler for mødrene under svangerskapet (veke 14 og 24-28 av svangerskapet): mors alder (år), BMI (kg/m2, klassifisering), vekt (kg), høyde (m), svangerskapsalder (uke + dager) , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), triglyserider, kolesterol, LDL-kolesterol, VLDL, HDL (alle i mg/dl), fastende glykemi (mg/dl) og insulin (pg/mL), HOMA-IR, adiponectin (ug/mL), plasmanivåer av DHA (μmol/l).
• Uavhengige variabler for moren ved fødselen: vektøkning i svangerskapet (kg, klassifisering), type fødsel, arbeidstimer.
• Uavhengige variabler for det nyfødte: kjønn, alder (uker ved fødsel, postnatale uker), vekt (g), lengde (cm), hodeomkrets (cm), ponderal indeks (kg/m3), vekt for svangerskapsalder (klassifisering), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), plasmanivåer av DHA (μmol/l), hudfolder (mm) (biceps, triceps, subscapular, suprailiac og tight).
• Andre morsvariabler: paritet, røykevane, utdanning (år), type fødsel, placentavekt (g).

EX VIVO & IN VITRO STUDIER NAVELLEVELLEVELBLOD. Navlestrengsblod samles opp etter fødsel og før placentautdrivelse i Terumo-blodoppsamlingsposer (40-100 ml) og oppbevares ved 4°C frem til behandling (innen 1-5 timer etter levering).

DHA-NIVÅER I MODER- OG FOSTERBLOD: Disse vil bli målt i MIGHT Study ved gasskromatografi.

MONOCYTTISOLERING, CELLEKULTUR OG MAKROFAGEDFFERENSIERING. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) separeres kort tid etter fødselen ved hjelp av Ficoll-tetthetsgradient ved bruk av Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) sentrifugering og inkuberes i RPMI 1640-medium (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) og sås ved tetthet på 8 til 10 × 106 celler/ml i 100 mm kulturskåler ved 5 % CO2 i 2 timer ved 37°C. Monocyttidentitet vurderes ved flowcytometri. Monocytter dyrkes i 7 dager for å vurdere makrofagdifferensiering. Makrofagpolarisering induseres ved å eksponere i 24 timer for 100 ng/mL LPS (SigmaAldrich, Missouri, USA) og 20 ng/mL INFγ (R&D Systems, Minneapolis, USA) for M1 eller, alternativt, for 20 ng/mL av IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, USA) for M2 i RPMI-medium supplert med 5 % FBS.

Celler sås på plastkulturskåler og holdes i en inkubator med kontrollert atmosfære, ved 37 °C med forskjellige eksperimentelle forhold.

KVANTIFISERING AV PRO- OG ANTI-INFLAMMATORISKE CYTOKINER, INSULIN, LEPTIN OG ADIPONEKTIN I MØDRE-, NEONATAL OG SPEDBARNSPLASMA.

Disse pro- og antiinflammatoriske mediatorene, leptin og insulin, kvantifiseres ved hjelp av en multiplekset (Bio-Plex-plattform) immunometrisk analyse (MILLIPLEX xMAP High Sensitivity Human Cytokine Panel, og human metabolic panel, Millipore, Billerica, MA, USA). Kvantifisering av totalt adiponectin i navlestrengsplasma gjøres med High Molecular Weight & Total Adiponectin (ALPCO) ELISA-sett, i henhold til produsentens instruksjoner.

FREMSTILLING AV PLASENTALE HOMOGENATER. Placenta samles ved levering og veies etter trimming av snor og membraner, legges umiddelbart på is etter fødsel og dissekeres. Chorionplaten, fostersekken og decidua fjernet. Omtrent 50 g villøst vev kuttes i små biter og skylles med iskaldt fysiologisk saltvann. Vev vil bli plassert i iskald buffer D [250 mM sukrose, 0,7 μM pepstatin A, 1,6 μM antismerte, 80 μM aprotinin, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-Tris (pH 7,4)] ved 4°C og homogenisert på is. ved hjelp av en polytron. Homogenatet hurtigfryses i flytende nitrogen og lagres ved -80°C inntil analyse eller videre bearbeiding.

KVANTITATIV PCR FOR IN VITRO EKSPRESJON AV CYTOKINER. RNA isoleres fra monocytter ved å bruke et kommersielt sett (GenElute, Sigma), i henhold til produsentens instruksjoner. RT utføres med ImProm-II Reverse.

Transkripsjonssystem (Promega). PCR utføres ved bruk av oligonukleotidprimere for human TNFa, IL-6, Il-1β, MCP-1 og IL-10. Nivåene av mRNA for GADPH, ATP5F1 og RPLP2 brukes som interne referanser. Primere er validert for bruk: kontroll av amplifikasjon, primerkonsentrasjoner, effektivitetsprimere-HK og stabilitet av HK under eksperimentelle forhold. Relativt uttrykk for målgener beregnes ved å bruke 2-delta delta ct-metoden.

FLØMSCYTOMETRI FOR MONOCYTER KARATERISERING. Ekspresjonen av forskjellige overflatemarkører evalueres ved hjelp av flowcytometri, som utføres enten i fullblod for identifikasjon av monocyttsubtyper eller in vitro differensierte makrofager for identifikasjon av immunfenotypen. Blant sirkulerende monocytter (CD86+-celler) vurderes klassiske og ikke-klassiske undertyper i henhold til deres overflateuttrykk av CD14 og CD16.

Immunfenotype av makrofager (dvs. M1 og M2) vurderes i henhold til uttrykket av spesifikke markører (f.eks. CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFα, NO produksjon). Prøver farges i laboratoriet og sendes til et strømningscytometrianlegg ved Universidad de Chile (CyAnTM ADP-analysator (Beckman Coulter®), innen 48 timer.

GLOBAL DNA METYLOME. DNA Methylome-analysen er gjort i samarbeid med Dr. Graham Burdge og Dr. Karen Lillycrop fra Southampton ved å bruke Infinium Methylation EPIC BeadChip-settet fra Illumina.

DNA METYLASJONSANALYSE. DNA-metyleringsstatus for promoterregionene (omtrent 400 bp fra transkripsjonsstartstedet) til genene som koder for TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARγ og PCG1α vil bli bestemt ved bruk av bisulfitt modifikasjon koblet til DNA-sekvensering. Kort fortalt vil totale DNA-ekstrakter fra celler behandles med natriumbisulfitt for å konvertere ikke-metylert cytosin til uracil, og promoterregioner vil bli amplifisert ved PCR ved bruk av spesifikt i henhold til strategien brukt og publisert av vår gruppe. Kort fortalt vil en av PCR-primerne bli designet inkludert en 5'-biotin-tag, som vil tillate rensing av amplikonet direkte fra PCR-blandingen. Deretter vil biotinholdig amplifisert DNA-streng overføres til en PyroMark Q96 MD pyrosequencer (Qiagen) for sekvensering. Stedspesifikke CpG-metyleringer vil bli bestemt som prosent, og sammenligner signalintensiteten til ikke-bisulfittsensitiv CpG (konservert C, metylert CpG) og bisulfittsensitiv CpG (konvertert C→T, umetylert CpG).

STATISTISK ANALYSE. For beskrivende statistikk vil det bli brukt gjennomsnitt ± SD eller median og interkvartilområde for kvantitative variabler, og prosent med n for kategorier. Distribusjoner vil bli verifisert med en Shapiro Wilk-test. Forskjeller i fettmasse og sirkulerende markører vil bli bestemt av ANOVA eller Kruskal Wallis i henhold til datafordeling. Spearman (parametrisk) eller Pearson (ingen parametrisk) korrelasjon vil bli brukt for å bestemme assosiasjonen mellom avhengige og uavhengige (mor og neonatale) variabler. Uavhengige variabler vil bli tilpasset logistiske og lineære regresjonsmodeller for å evaluere interaksjoner samt identifisere forstyrrende faktorer. For in vitro-studier vil sammenligninger mellom to eller flere grupper utføres ved hjelp av henholdsvis Students uparrede t-test og variansanalyse (ANOVA). Hvis ANOVA viser en signifikant interaksjon mellom variabler, ble post hoc-analyser utført av Dunns ved sammenligning av utvalgte grupper og Bonferroni-korreksjonstest med flere sammenligninger. Data for in vitro-responser på cytokiner vil bli tilpasset dose-responskurver hvorfra maksimal respons og medikamentstyrke (pD2 = -Log EC50) vil bli oppnådd. Sammenligning av kurver og maksimal respons under ulike forhold vil bli analysert med ANOVA. Alle analysene vil bli utført med den statistiske programvaren Graphpad Prism, STATA eller SPSS med tanke på en p<0,05 som grenseverdi for statistisk signifikans.