Programmation fœtale de la réponse immunitaire et de la graisse corporelle par l'obésité maternelle (EpiFat)

OBJECTIFS :

Chez les nouveau-nés nés de femmes enceintes avec un IMC normal (> 18,5 et <24,9) à la première visite prénatale (<14 semaines de gestation) (Groupe de référence) et avec une obésité pré-gestationnelle (IMC >30 Kg/m2) avec un faible Apport (habituel) de DHA (200 mg/jour) (Groupe MO) et les femmes obèses pré-gestationnelles complétées par une forte dose de DHA (800 mg/jour) (Groupe MO+DHA) nous allons :

• Analyser si la supplémentation maternelle en DHA modifie la composition corporelle des nouveau-nés et des enfants à 4 mois.
• Déterminer si la supplémentation maternelle en DHA pendant la grossesse modifie l'équilibre des cytokines pro- et anti-inflammatoires circulantes et des marqueurs métaboliques chez la mère pendant la grossesse, le fœtus, le placenta et l'enfant à 4 mois
• Déterminer si la réponse des macrophages aux médiateurs inflammatoires s'associe à des marqueurs épigénétiques altérés dans les gènes pro- et anti-inflammatoires liés à l'obésité dans les monocytes fœtaux de mères obèses et si la supplémentation maternelle en DHA inverse ce phénotype.
• Déterminer si l'obésité maternelle se traduit par des changements dans le profil de méthylation de l'ADN à l'échelle du génome dans les monocytes fœtaux à la naissance et l'impact de la supplémentation maternelle en DHA sur cet effet épigénétique.

MÉTHODOLOGIE. L'étude EpiFat est une cohorte emboîtée dans l'étude MIGHT (Contrôle de l'obésité maternelle par la nutrition saine, MIGHT) (PI : Dr Garmendia NCT02574767). L'étude MIGHT a randomisé 1 000 patientes ayant commencé leurs soins prénatals avant 14 semaines de gestation dans l'un des quatre groupes d'étude parallèles : 2 groupes ont reçu 200 mg/jour de DHA (à base d'huile de Schizochytrium, 100 % de DHA, DSM) et 2 groupes 800 mg/jour DHA, chaque groupe avait un groupe avec et un sans intervention à domicile sur l'alimentation et l'activité physique.

Recrutement et suivi : lors de l'admission à l'unité de pré-accouchement, les sages-femmes de l'hôpital Dr. Sótero del Río invitent toutes les femmes enceintes qui remplissent les critères d'éligibilité à participer à cette étude et effectuent un processus de consentement éclairé.

Après le recrutement dans l'étude EpiFat, au moment de l'accouchement, la sage-femme prélève des échantillons de sang de cordon et le tissu placentaire. Entre 24h et 48h. après l'accouchement, les patientes reçoivent la visite de la sage-femme chercheuse pour effectuer une anthropométrie sur le nouveau-né et recueillir des données sociodémographiques et des informations cliniques sur la santé des femmes et le processus d'accouchement.

À 4 mois, les nourrissons ont une visite, au Centre de recherche sur l'environnement alimentaire et la prévention des maladies chroniques associées à la nutrition (CIAPEC pour son acronyme espagnol) de l'Institut de nutrition et de technologie alimentaire (INTA pour son acronyme espagnol), pour évaluer l'anthropométrie et composition corporelle. Lors de cette visite, des échantillons de sang du nourrisson (5 ml) et des informations sur l'état de santé du nourrisson sont collectés. En outre, une anthropométrie maternelle est effectuée et des enquêtes sur l'alimentation du nourrisson et la fréquence alimentaire sont appliquées à la mère.

Taille de l'échantillon:

Pour calculer la taille de l'échantillon, le pourcentage de graisse corporelle (résultat principal) a été considéré comme une différence moyenne de 2,5 % et 3,0 SD qui ont été décrits par Catalano. En considérant une puissance de 80 % et une valeur de p de 0,05, l'estimation de la taille de l'échantillon était de 45 sujets par groupe. Le calcul a été effectué à l'aide du logiciel Statistics/Data Analysis STATA version 14.0 (Texas, USA). Considérant 20 % de perdus de vue, la taille de l'échantillon a été ajustée à 54 sujets par groupe.

Pour le résultat secondaire "la réponse inflammatoire épigénétique des macrophages néonatals in vitro", aucune preuve n'a été publiée. Cependant, des études antérieures de notre groupe ont montré que : Pour le % de méthylation dans le promoteur de l'IL-1β, une taille d'échantillon de 15 nouveau-nés par groupe de poids normal et de mère obèse était suffisante pour trouver une différence statistique entre les groupes, et pour l'IL -10 dans les macrophages dérivés de monocytes néonataux 10 sujets par groupe étaient nécessaires. Par conséquent, pour ces résultats, il a été considéré comme un échantillon de 15 sujets par groupe.

VARIABLES NÉONATALES ET MATERNELLES DE L'ÉTUDE.

Les variables incluses dans l'étude sont :

• Variables des nouveau-nés/nourrissons : % de graisse corporelle et réponse inflammatoire épigénétique dans les macrophages néonataux.
• Variables indépendantes des mères pendant la grossesse (semaine 14 et 24-28 de grossesse) : âge maternel (ans), IMC (kg/m2, classification), poids (kg), taille (m), âge gestationnel (semaine + jours) , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), triglycérides, cholestérol, LDL-cholestérol, VLDL, HDL (tous en mg/dl), glycémie à jeun (mg/dL) et insuline (pg/mL), HOMA-IR, adiponectine (ug/mL), taux plasmatiques de DHA (μmol/l).
• Variables indépendantes de la mère à la naissance : gain de poids gestationnel (kg, classification), type d'accouchement, heures de travail.
• Variables indépendantes du nouveau-né : sexe, âge (semaines à la naissance, semaines postnatales), poids (g), taille (cm), tour de tête (cm), index pondéral (kg/m3), poids pour l'âge gestationnel (classification), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/mL), taux plasmatiques de DHA (μmol/l), plis cutanés (mm) (biceps, triceps, sous-scapulaire, supra-iliaque et serré).
• Autres variables maternelles : parité, tabagisme, éducation (années), type d'accouchement, poids placentaire (g).

ÉTUDES EX VIVO ET IN VITRO SANG DE CORDON OMBILICAL. Le sang du cordon ombilical est prélevé après l'accouchement et avant l'expulsion du placenta dans des poches de prélèvement sanguin Terumo (40-100 ml) et conservé à 4°C jusqu'au traitement (dans les 1 à 5 heures suivant l'accouchement).

NIVEAUX DE DHA DANS LE SANG MATERNEL ET FŒTAL : Ceux-ci seront mesurés dans l'étude MIGHT par chromatographie en phase gazeuse.

ISOLEMENT DES MONOCYTES, CULTURE CELLULAIRE ET DIFFÉRENCIATION DES MACROPHAGES. Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) sont séparées peu après la naissance par gradient de densité de Ficoll en utilisant la centrifugation Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, Missouri, US) et incubées dans du milieu RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Missouri, US) et ensemencées à une densité de 8 à 10 × 106 cellules/mL dans des boîtes de culture de 100 mm à 5 % de CO2 pendant 2 h à 37 °C. L'identité des monocytes est évaluée par cytométrie en flux. Les monocytes sont cultivés pendant 7 jours pour évaluer la différenciation des macrophages. La polarisation des macrophages est induite en exposant pendant 24 heures à 100 ng/mL de LPS (SigmaAldrich, Missouri, US) et 20 ng/mL d'INFγ (R&D Systems, Minneapolis, US) pour M1 ou, alternativement, à 20 ng/mL de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, US) pour M2 en milieu RPMI additionné de 5% de FBS.

Les cellules sont ensemencées sur des boîtes de culture en plastique et maintenues dans un incubateur à atmosphère contrôlée, à 37°C avec différentes conditions expérimentales.

QUANTIFICATION DES CYTOKINES PRO- ET ANTI-INFLAMMATOIRES, DE L'INSULINE, DE LA LEPTINE ET DE L'ADIPONECTINE DANS LE PLASMA MATERNEL, NÉONATAL ET NOURRISSON.

Ces médiateurs pro et anti-inflammatoires, la leptine et l'insuline sont quantifiés à l'aide d'un test immunométrique multiplexé (plate-forme Bio-Plex) (MILLIPLEX xMAP High Sensitivity Human Cytokine Panel, et panel métabolique humain, Millipore, Billerica, MA, USA). La quantification de l'adiponectine totale dans le plasma du cordon ombilical est effectuée avec le kit ELISA High Molecular Weight & Total Adiponectin (ALPCO), conformément aux instructions du fabricant.

PRÉPARATION DES HOMOGÉNÉS PLACENTAIRES. Les placentas sont prélevés à l'accouchement et pesés après rognage du cordon et des membranes, immédiatement placés sur de la glace après l'accouchement et disséqués. La plaque chorionique, le sac amniotique et la caduque ont été retirés. Environ 50 g de tissu villeux sont coupés en petits morceaux et rincés avec du sérum physiologique glacé. Le tissu sera placé dans un tampon glacé D [saccharose 250 mM, pepstatine A 0,7 μM, antipain 1,6 μM, aprotinine 80 μM, EDTA 1 mM, HEPES-Tris 10 mM (pH 7,4)] à 4 ° C et homogénéisé sur glace à l'aide d'un polytron. L'homogénat est congelé instantanément dans de l'azote liquide et stocké à -80°C jusqu'à analyse ou traitement ultérieur.

PCR QUANTITATIVE POUR L'EXPRESSION IN VITRO DE CYTOKINES. L'ARN est isolé des monocytes à l'aide d'un kit commercial (GenElute, Sigma), selon les instructions du fabricant. La RT est effectuée avec l'ImProm-II Reverse.

Système de transcription (Promega). La PCR est réalisée en utilisant des amorces oligonucléotidiques pour le TNFα humain, l'IL-6, l'IL-1β, le MCP-1 et l'IL-10. Les niveaux d'ARNm pour GADPH, ATP5F1 et RPLP2 sont utilisés comme références internes. Les amorces sont validées pour une utilisation : vérification de l'amplification, des concentrations d'amorces, de l'efficacité des amorces-HK et de la stabilité des HK dans les conditions expérimentales. L'expression relative des gènes cibles est calculée à l'aide de la méthode 2-delta delta ct.

CYTOMÉTRIE EN FLUX POUR LA CARACTÉRISATION DES MONOCYTES. L'expression de différents marqueurs de surface est évaluée à l'aide de la cytométrie en flux, qui est réalisée soit dans le sang total pour l'identification des sous-types de monocytes, soit dans des macrophages différenciés in vitro pour l'identification de l'immunophénotype. Parmi les monocytes circulants (cellules CD86+), les sous-types classiques et non classiques sont évalués en fonction de leur expression de surface de CD14 et CD16.

Immunophénotype des macrophages (c.-à-d. M1 et M2) sont évalués en fonction de l'expression de marqueurs spécifiques (ex. CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFα, production de NO). Les échantillons sont colorés en laboratoire et envoyés à une installation de cytométrie en flux à l'Université du Chili (analyseur CyAnTM ADP (Beckman Coulter®), dans les 48 heures.

MÉTHYLOME D'ADN GLOBAL. L'analyse de l'ADN Methylome est effectuée en collaboration avec le Dr Graham Burdge et le Dr Karen Lillycrop de Southampton à l'aide du kit Infinium Methylation EPIC BeadChip d'Illumina.

ANALYSE DE MÉTHYLATION DE L'ADN. Le statut de méthylation de l'ADN des régions promotrices (à environ 400 pb du site de début de transcription) des gènes codant pour TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARγ et PCG1α sera déterminé à l'aide de bisulfite modification couplée au séquençage de l'ADN. Brièvement, des extraits d'ADN totaux de cellules seront traités au bisulfite de sodium pour convertir la cytosine non méthylée en uracile, et les régions promotrices seront amplifiées par PCR en utilisant des spécificités selon la stratégie utilisée et publiée par notre groupe. En bref, l'une des amorces PCR sera conçue avec une étiquette 5'-biotine, qui permettra de purifier l'amplicon directement à partir du mélange PCR. Ensuite, le brin d'ADN amplifié contenant de la biotine sera transféré dans un pyroséquenceur PyroMark Q96 MD (Qiagen) pour le séquençage. Les méthylations CpG spécifiques au site seront déterminées en pourcentage, en comparant l'intensité du signal des CpG non sensibles au bisulfite (C conservé, CpG méthylé) et des CpG sensibles au bisulfite (C → T converti, CpG non méthylé).

ANALYSES STATISTIQUES. Pour les statistiques descriptives, on appliquera la moyenne ± SD ou la médiane et l'intervalle interquartile pour les variables quantitatives, et le pourcentage avec n pour les catégories. Les distributions seront vérifiées avec un test de Shapiro Wilk. Les différences de masse grasse et de marqueurs circulants seront déterminées par ANOVA ou Kruskal Wallis selon la distribution des données. La corrélation de Spearman (paramétrique) ou de Pearson (non paramétrique) sera appliquée pour déterminer l'association entre les variables dépendantes et indépendantes (maternelles et néonatales). Des variables indépendantes seront ajustées aux modèles de régression logistique et linéaire pour évaluer les interactions ainsi que pour identifier les facteurs de confusion. Pour les études in vitro, les comparaisons entre deux groupes ou plus seront effectuées au moyen du test t non apparié de Student et de l'analyse de variance (ANOVA), respectivement. Si l'ANOVA démontre une interaction significative entre les variables, des analyses post hoc ont été effectuées par Dunns lors de la comparaison de groupes sélectionnés et du test de correction de Bonferroni à comparaison multiple. Les données pour les réponses in vitro aux cytokines seront ajustées aux courbes dose-réponse à partir desquelles la réponse maximale et la puissance du médicament (pD2 = -Log EC50) seront obtenues. La comparaison des courbes et des réponses maximales dans différentes conditions sera analysée par ANOVA. Toutes les analyses seront effectuées avec le logiciel statistique Graphpad Prism, STATA ou SPSS en considérant un p<0,05 comme seuil de signification statistique.