Fetale Programmierung von Immunantwort und Körperfett durch mütterliche Fettleibigkeit (EpiFat)

ZIELE:

Bei Neugeborenen von schwangeren Frauen mit normalem BMI (> 18,5 und < 24,9) beim ersten pränatalen Besuch (< 14 Schwangerschaftswochen) (Referenzgruppe) und mit prägestationaler Adipositas (BMI > 30 kg/m2) mit niedrigem (übliche) DHA-Einnahme (200 mg/Tag) (MO-Gruppe) und fettleibige Frauen vor der Schwangerschaft, die mit einer hohen Dosis DHA (800 mg/Tag) (MO+DHA-Gruppe) ergänzt werden, werden wir:

• Analysieren Sie, ob eine mütterliche DHA-Supplementierung die Körperzusammensetzung bei Neugeborenen und Kindern im Alter von 4 Monaten verändert.
• Bestimmen Sie, ob eine mütterliche Nahrungsergänzung mit DHA während der Schwangerschaft das Gleichgewicht der zirkulierenden pro- und antiinflammatorischen Zytokine und Stoffwechselmarker bei der Mutter während der Schwangerschaft, dem Fötus, der Plazenta und dem Kind im Alter von 4 Monaten verändert
• Bestimmen Sie, ob die Reaktion von Makrophagen auf Entzündungsmediatoren mit veränderten epigenetischen Markern in pro- und antiinflammatorischen Genen im Zusammenhang mit Fettleibigkeit in fetalen Monozyten von fettleibigen Müttern zusammenhängt und ob eine mütterliche DHA-Supplementierung diesen Phänotyp umkehrt.
• Bestimmen Sie, ob mütterliche Fettleibigkeit zu Veränderungen im genomweiten DNA-Methylierungsprofil in fötalen Monozyten bei der Geburt führt und welchen Einfluss die mütterliche DHA-Supplementierung auf diesen epigenetischen Effekt hat.

METHODIK. Die EpiFat-Studie ist eine verschachtelte Kohorte in der MIGHT-Studie zur Kontrolle der mütterlichen Fettleibigkeit durch gesunde Ernährung (PI: Dr. Garmendia NCT02574767). In der MIGHT-Studie wurden 1000 Patientinnen, die ihre Schwangerschaftsvorsorge vor der 14. Schwangerschaftswoche begonnen hatten, randomisiert einem von vier parallelen Studienarmen zugeteilt: 2 Gruppen erhielten 200 mg/Tag DHA (basierend auf Schizochytriumöl, 100 % DHA, DSM) und 2 Gruppen 800 mg/Tag DHA, jede Gruppe hatte eine Gruppe mit und eine ohne Interventionen zu häuslicher Ernährung und körperlicher Aktivität.

Rekrutierung und Nachbetreuung: Bei der Aufnahme in die Entbindungsstation laden Hebammen des Krankenhauses Dr.

Nach der Rekrutierung in die EpiFat-Studie entnimmt die Hebamme zum Zeitpunkt der Entbindung Nabelschnurblutproben und das Plazentagewebe. Zwischen 24 und 48 Stunden. Nach der Entbindung werden die Patienten von der Forschungshebamme besucht, um eine Anthropometrie am Neugeborenen durchzuführen und soziodemografische Daten sowie klinische Informationen über die Gesundheit der Frau und den Entbindungsprozess zu sammeln.

Im Alter von 4 Monaten werden die Säuglinge im Forschungszentrum für Ernährungsumgebung und Prävention ernährungsbedingter chronischer Krankheiten (CIAPEC für sein spanisches Akronym) des Instituts für Ernährung und Lebensmitteltechnologie (INTA für sein spanisches Akronym) besucht, um die Anthropometrie zu bewerten und Körperzusammensetzung. Bei diesem Besuch werden Säuglingsblutproben (5 ml) und Informationen zum Gesundheitszustand des Säuglings gesammelt. Darüber hinaus wird eine mütterliche Anthropometrie durchgeführt und es werden Erhebungen zur Säuglingsernährung und Nahrungshäufigkeit bei der Mutter durchgeführt.

Probengröße:

Zur Berechnung der Stichprobengröße für den Körperfettanteil (primäres Ergebnis) wurde eine mittlere Differenz von 2,5 % und 3,0 SD berücksichtigt, die von Catalano beschrieben wurden. Unter Berücksichtigung einer Trennschärfe von 80 % und eines p-Werts von 0,05 betrug die geschätzte Stichprobengröße 45 Probanden pro Gruppe. Die Berechnung erfolgte mit der Software Statistics/Data Analysis STATA Version 14.0 (Texas, USA). Unter Berücksichtigung eines Verlusts von 20 % für die Nachbeobachtung wurde die Stichprobengröße auf 54 Probanden pro Gruppe angepasst.

Für den sekundären Endpunkt „die epigenetisch bedingte Entzündungsreaktion neonataler Makrophagen in vitro“ liegen keine veröffentlichten Belege vor. Frühere Studien unserer Gruppe haben jedoch Folgendes gezeigt: Für den Prozentsatz der Methylierung im IL-1β-Promotor reichte eine Stichprobengröße von 15 Neugeborenen pro Gruppe aus normalgewichtigen und fettleibigen Müttern aus, um einen statistischen Unterschied zwischen den Gruppen und für IL festzustellen -10 in Makrophagen, die aus neonatalen Monozyten stammen, waren 10 Probanden pro Gruppe erforderlich. Daher wurde für diese Ergebnisse eine Stichprobengröße von 15 Probanden pro Gruppe angenommen.

NEUGEBORENE UND MÜTTERLICHE VARIABLEN DER STUDIE.

Die in die Studie einbezogenen Variablen sind:

• Variablen von Neugeborenen/Säuglingen: % des Körperfetts und epigenetisch bedingte Entzündungsreaktion in neonatalen Makrophagen.
• Unabhängige Variablen der Mütter während der Schwangerschaft (14. und 24.–28. Schwangerschaftswoche): mütterliches Alter (Jahre), BMI (kg/m2, Klassifizierung), Gewicht (kg), Größe (m), Gestationsalter (Woche + Tage) , IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/ml), Triglyceride, Cholesterin, LDL-Cholesterin, VLDL, HDL (alle in mg/dl), Nüchternglykämie (mg/dl) und Insulin (pg/ml), HOMA-IR, Adiponektin (ug/ml), Plasmaspiegel von DHA (μmol/l).
• Unabhängige Variablen der Mutter bei der Geburt: Gewichtszunahme während der Schwangerschaft (kg, Klassifizierung), Art der Entbindung, Wehenstunden.
• Unabhängige Variablen des Neugeborenen: Geschlecht, Alter (Geburtswochen, Wochen nach der Geburt), Gewicht (g), Länge (cm), Kopfumfang (cm), Gewichtsindex (kg/m3), Gewicht für Gestationsalter (Klassifizierung), IL-6, IL-1β, TNFα, MCP-1, IL-10 (pg/ml), Plasmaspiegel von DHA (μmol/l), Hautfalten (mm) (Bizeps, Trizeps, Subscapularis, Suprailiac und Tight).
• Weitere mütterliche Variablen: Parität, Rauchgewohnheiten, Bildung (Jahre), Art der Entbindung, Plazentagewicht (g).

EX-VIVO- UND IN-VITRO-STUDIEN Nabelschnurblut. Nabelschnurblut wird nach der Entbindung und vor dem Ausstoß aus der Plazenta in Terumo-Blutsammelbeuteln (40–100 ml) gesammelt und bis zur Verarbeitung (innerhalb von 1–5 Stunden nach der Entbindung) bei 4 °C gelagert.

DHA-GEHALTE IM MÜTTERLICHEN UND Fötalen Blut: Diese werden in der MIGHT-Studie durch Gaschromatographie gemessen.

MONOZYTEN-ISOLIERUNG, ZELLKULTUR UND MAKROPHAGEN-DIFFERENZIERUNG. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) werden kurz nach der Geburt durch einen Ficoll-Dichtegradienten unter Verwendung einer Histopaque-1077-Zentrifugation (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) abgetrennt und in RPMI 1640-Medium (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) inkubiert und bei einer Dichte von ausgesät 8 bis 10 × 106 Zellen/ml in 100-mm-Kulturschalen bei 5 % CO2 für 2 Stunden bei 37 °C. Die Monozytenidentität wird mittels Durchflusszytometrie beurteilt. Monozyten werden 7 Tage lang kultiviert, um die Makrophagendifferenzierung zu beurteilen. Die Makrophagenpolarisierung wird durch 24-stündige Exposition gegenüber 100 ng/ml LPS (SigmaAldrich, Missouri, USA) und 20 ng/ml INFγ (R&D Systems, Minneapolis, USA) für M1 oder alternativ 20 ng/ml LPS (SigmaAldrich, Missouri, USA) induziert IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, USA) für M2 in RPMI-Medium, ergänzt mit 5 % FBS.

Die Zellen werden auf Kulturschalen aus Kunststoff ausgesät und in einem Inkubator mit kontrollierter Atmosphäre bei 37 °C und verschiedenen Versuchsbedingungen gehalten.

QUANTIFIZIERUNG PRO- UND ENTZÜNDUNGSHEMMENDER ZYTOKINE, INSULIN, LEPTIN UND ADIPONEKTIN IM PLASMA VON MÜTTERN, NEONATALEN UND SÄUGLINGEN.

Diese entzündungshemmenden und entzündungshemmenden Mediatoren, Leptin und Insulin, werden mithilfe eines immunometrischen Multiplex-Assays (Bio-Plex-Plattform) (MILLIPLEX xMAP High Sensitivity Human Cytokine Panel und Human Metabolic Panel, Millipore, Billerica, MA, USA) quantifiziert. Die Quantifizierung des Gesamtadiponektins im Nabelschnurplasma erfolgt mit dem High Molecular Weight & Total Adiponectin (ALPCO) ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

HERSTELLUNG VON PLAZENTAHOMOGENATEN. Plazenten werden bei der Entbindung gesammelt und nach dem Abschneiden der Nabelschnur und Membranen gewogen, unmittelbar nach der Entbindung auf Eis gelegt und präpariert. Die Chorionplatte, die Fruchtblase und die Dezidua wurden entfernt. Etwa 50 g Zottengewebe werden in kleine Stücke geschnitten und mit eiskalter physiologischer Kochsalzlösung gespült. Das Gewebe wird in eiskalten Puffer D [250 mM Saccharose, 0,7 μM Pepstatin A, 1,6 μM Antipain, 80 μM Aprotinin, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-Tris (pH 7,4)] bei 4 °C gegeben und auf Eis homogenisiert mit einem Polytron. Das Homogenat wird in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Analyse oder Weiterverarbeitung bei -80 °C gelagert.

QUANTITATIVE PCR ZUR IN-VITRO-EXPRESSION VON ZYTOKINEN. RNA wird aus Monozyten mit einem kommerziellen Kit (GenElute, Sigma) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. RT wird mit dem ImProm-II Reverse durchgeführt.

Transkriptionssystem (Promega). Die PCR wird unter Verwendung von Oligonukleotidprimern für menschliches TNFα, IL-6, Il-1β, MCP-1 und IL-10 durchgeführt. Die mRNA-Spiegel für GADPH, ATP5F1 und RPLP2 werden als interne Referenzen verwendet. Primer werden für den Einsatz validiert: Überprüfung der Amplifikation, Primerkonzentrationen, Primer-HK-Effizienz und Stabilität von HK unter experimentellen Bedingungen. Die relative Expression der Zielgene wird mithilfe der 2-Delta-Delta-CT-Methode berechnet.

DURCHFLUSSZYTOMETRIE ZUR CHARATERISIERUNG VON MONOZYTEN. Die Expression verschiedener Oberflächenmarker wird mittels Durchflusszytometrie ausgewertet, die entweder im Vollblut zur Identifizierung von Monozyten-Subtypen oder in in vitro differenzierten Makrophagen zur Identifizierung des Immunphänotyps durchgeführt wird. Unter den zirkulierenden Monozyten (CD86+-Zellen) werden klassische und nicht-klassische Subtypen anhand ihrer Oberflächenexpression von CD14 und CD16 beurteilt.

Immunphänotyp von Makrophagen (d. h. M1 und M2) werden anhand der Expression spezifischer Marker (z. B. CCR2, CXCL13, CX3CR, CD62L, KLF4, TNFα, NO-Produktion). Die Proben werden im Labor gefärbt und innerhalb von 48 Stunden an eine Durchflusszytometrie-Einrichtung an der Universidad de Chile (CyAnTM ADP-Analysegerät (Beckman Coulter®)) geschickt.

GLOBALE DNA-METHYLOME. Die DNA-Methylome-Analyse wird in Zusammenarbeit mit Dr. Graham Burdge und Dr. Karen Lillycrop aus Southampton unter Verwendung des Infinium Methylation EPIC BeadChip-Kits von Illumina durchgeführt.

DNA-METHYLIERUNGSANALYSE. Der DNA-Methylierungsstatus der Promotorregionen (ungefähr 400 bp von der Transkriptionsstartstelle entfernt) der Gene, die für TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, IL-10, PPARγ und PCG1α kodieren, wird mithilfe von Bisulfit bestimmt Modifikation gekoppelt an DNA-Sequenzierung. Kurz gesagt werden Gesamt-DNA-Extrakte aus Zellen mit Natriumbisulfit behandelt, um nicht methyliertes Cytosin in Uracil umzuwandeln, und Promotorregionen werden durch PCR unter Verwendung spezifischer Verfahren gemäß der von unserer Gruppe verwendeten und veröffentlichten Strategie amplifiziert. Kurz gesagt, einer der PCR-Primer wird so gestaltet, dass er einen 5'-Biotin-Tag enthält, der die Reinigung des Amplifikats direkt aus dem PCR-Mix ermöglicht. Anschließend wird der biotinhaltige amplifizierte DNA-Strang zur Sequenzierung auf einen PyroMark Q96 MD-Pyrosequenzierer (Qiagen) übertragen. Ortsspezifische CpG-Methylierungen werden als Prozentsatz bestimmt, indem die Signalintensität von nicht Bisulfit-sensitivem CpG (konserviertes C, methyliertes CpG) und Bisulfit-sensitivem CpG (konvertiertes C→T, unmethyliertes CpG) verglichen wird.

STATISTISCHE ANALYSE. Für die deskriptive Statistik werden der Mittelwert ± SD oder der Median und der Interquartilbereich für quantitative Variablen und der Prozentsatz mit n für Kategorien angewendet. Die Verteilungen werden mit einem Shapiro-Wilk-Test überprüft. Unterschiede in der Fettmasse und den zirkulierenden Markern werden durch ANOVA oder Kruskal Wallis entsprechend der Datenverteilung bestimmt. Spearman-Korrelation (parametrisch) oder Pearson-Korrelation (nicht parametrisch) wird angewendet, um den Zusammenhang zwischen abhängigen und unabhängigen (mütterlichen und neonatalen) Variablen zu bestimmen. Unabhängige Variablen werden an logistische und lineare Regressionsmodelle angepasst, um Interaktionen zu bewerten und Störfaktoren zu identifizieren. Bei In-vitro-Studien werden Vergleiche zwischen zwei oder mehr Gruppen mithilfe des ungepaarten Student-T-Tests bzw. der Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Wenn die ANOVA eine signifikante Interaktion zwischen Variablen zeigt, wurden Post-hoc-Analysen von Dunns beim Vergleich ausgewählter Gruppen und beim Bonferroni-Korrekturtest mit mehreren Vergleichen durchgeführt. Daten für In-vitro-Reaktionen auf Zytokine werden an Dosis-Wirkungs-Kurven angepasst, aus denen maximale Reaktion und Arzneimittelwirksamkeit (pD2 = -Log EC50) ermittelt werden. Der Vergleich von Kurven und maximalen Antworten unter verschiedenen Bedingungen wird durch ANOVA analysiert. Alle Analysen werden mit der Statistiksoftware Graphpad Prism, STATA oder SPSS durchgeführt, wobei ein p<0,05 als Grenzwert für die statistische Signifikanz berücksichtigt wird.