肺がんの予測マーカーとしての循環腫瘍 DNA と循環腫瘍細胞の包括的評価

肺がんは、男性と女性の両方で最も一般的ながんの種類のトップ 3 に入っているだけでなく、シンガポールと米国におけるがんによる死亡の主な原因でもあります。 プラチナベースの化学療法は現在、肺がん患者に対する薬物治療の主流となっているが、病気に関連した症状を一時的に軽減するだけである。 最近、分子標的療法の使用により、一部の患者の生存期間が改善されました。 特に、肺生検からの EGFR または ALK 変異の存在は、それぞれチロシンキナーゼ阻害剤またはクリゾチニブの使用による応答率の改善と無増悪生存期間を予測します。 重要なことに、EGFR変異は、非アジア人（約10％）と比較してアジア人患者（約35％）の腫瘍でより一般的である。

固形がん患者の死亡の主な原因は、血液循環を介した播種による転移です。 明らかな転移が起こる前であっても、循環中の腫瘍細胞の存在を検出する能力は、近年急速に進化している。 いくつかのがんにおいて循環腫瘍 DNA (ctDNA) と循環腫瘍細胞 (CTC) が予後において重要であることが判明しており、この技術は臨床的および生物学的に重要であることが広く認識されています。 この研究は、肺がん患者の疾患活動性と薬剤反応を予測する際のctDNAとCTCの使用を評価し、既存の方法を補完して、治療決定を導くための非侵襲的で正確な手段を実現する役割を果たします。

実際、リスク評価および治療モニタリングのためのマーカーとしてのctDNAおよびCTCの使用は、非侵襲的に定期的にモニタリングできるため、有利である。 これにより、監視プログラムと治療がより適切に調整され、病気の転帰が最適化されます。

研究者らは、3 つの主要な EGFR 変異を超高感度レベルで検出する EGFR 変異検出キットを開発しました。 研究者らはこれを、ホルマリン固定パラフィン包埋 DNA、胸水、循環 DNA、循環腫瘍細胞などのさまざまな臨床材料に適用し、キットがこれらの変異を高い感度と特異性で検出できることを発見しました。

全血サンプルから循環腫瘍細胞を効果的に分離するマイクロシーブ膜フィルター装置が、生物工学・ナノテクノロジー研究所によって開発されました。 このデバイスは、がん細胞と血液細胞のサイズの違いを利用して、10 分以内に 4.5 ml の全血から 85% 以上の回収率でマイクロシーブ フィルター上にがん細胞を捕捉します。これは、全血サンプルにがん細胞をスパイクした場合に実証されています。 このデバイスには、最適化された細孔直径 10 µm の高密度の細孔アレイ (> 8000 細孔/mm^2) が含まれています。 液体の調整と細胞の計数は、簡単な真空ポンプと実験用蛍光顕微鏡によって行われます。 捕捉された細胞は、CTC については抗 EpCAM-PE、白血球については抗 CD45-FITC、細胞核については 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) で染色されます。 CTC は、蛍光顕微鏡を使用して特徴付けられ、抗 EpCAM 陽性、抗 CD45 陰性、および DAPI 陽性で同定されます。

したがって、研究者らは予備研究から、当社の技術は循環腫瘍細胞の分離に有用であり、これらの循環腫瘍細胞は疾患活動性と相関する可能性が高く、健康な人には見られないという仮説を立てています。

循環腫瘍 DNA および循環腫瘍細胞のモニタリングは、従来の放射線学的方法と比較して、反応を判定する上で臨床的に価値のあるリードタイムを提供する可能性があります。

患者のコホートは、バイオマーカーのために組織と血液が収集される縦断的コホート研究のために募集されます。 介入は想定されていない。 研究は3年間にわたって実施される。

患者のサンプルと同意

今後6年間（2014年8月から2020年8月）にかけて、この研究に十分なインフォームドコンセントを提供した肺がんと診断された約150人の患者から腫瘍、血液、滲出液が採取される予定である。 他の場所からの患者はこれらのサイトに紹介される場合があります。

患者が臨床研究のための血液採取には同意していないが、標準的な外科的同意書の一部として、生検、細胞診、または外科的切除を含む研究目的での凍結またはホルマリン固定パラフィン包埋材料の採取について同意し、手術同意書に署名した場合、腫瘍組織と正常組織はチャンギ総合病院から収集されます。 腫瘍の病期分類と等級付けは、個々の臨床医の研究者による病理報告書のレビューと症例記録の評価から得られました。 研究目的で生検肺組織標本を取得する同意を含む、前向きに収集された臨床サンプルの分析に対する書面によるインフォームドコンセントがすべての患者から得られます。 医師の評価に応じて、気管支鏡検査、CTガイド下生検、開腹手術など、腫瘍の評価のために患者の組織を除去する推奨手順以外に追加の手順は必要ありません。 日常的な手順が完了すると、組織の 1 つが研究目的のために選択されます。 「研究用組織ブロック」は匿名化され、その後の病理学者による腫瘍の存在の検査/検証のためにスライドがバッチ化されます。

各見込み患者は、ベースラインの EDTA チューブ 3 本の血液 (合計約 30 ml) を提供します。 尿 DNA の研究のために、尿 (約 100 mL) も同時に採取されます。

これらの血液サンプルは 3000 rpm で 10 分間遠心分離され、マイクロアレイ分析によって同定されたバイオマーカーを検証するために血清と血漿が収集され、血液中の分泌タンパク質の候補が選択されます。

胸水（胸水または腹膜）は、治療する臨床医の推奨に従って日常的な治療手順の一部として採取されますが、そうでなければ廃棄されるはずです。 いかなる場合においても、この研究のみを目的として浸出液を採取することはありません。

CTC、末梢血単核球、DNA、RNA、タンパク質、その他の遺伝物質および分子物質の評価に関する下流の作業が実行されます。 適用される技術には、定量的 PCR、配列決定、フローサイトメトリーと免疫表現型検査、免疫組織化学、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション、培養などが含まれます。

突然変異解析:

遺伝物質は、ふるい上に捕捉された 3 ～ 5 mL の物質と血漿、および浸出液や尿などの関連物質から抽出されます。 これは、カスタム設計のプライマーおよび/またはシーケンスを使用した定量的 PCR によって分析されます。 また、BRAF、ALK、ROS、RET などの臨床的に実用的な変異を特定するために、次世代シーケンス技術を使用して遺伝物質のプロファイリングも行われます。

サンプルは新鮮に処理されます。 残りのサンプルはバフィーコートと血漿に分離され、液体窒素および/または-80℃で保存されます。

データと標本は研究室で処理するために匿名化されます。 各サイトは患者と検体を結び付ける情報を保持します。 これは経過観察の決定に必要です。

識別されたデータは、チャンギ総合病院内に物理的に配置され、施設のファイアウォールの内側にあるネットワーク PC 上に保管されます。 個人を特定できるデータは病院内に保管され、検査機関と共有されることはありません。

研究が完了すると、データは下流プロジェクト用にアーカイブされます。