En omfattande utvärdering av cirkulerande tumör-DNA och cirkulerande tumörceller som en prediktiv markör vid lungcancer

Lungcancer är inte bara bland de tre vanligaste cancertyperna hos både män och kvinnor, utan också den främsta orsaken till cancerdödlighet i Singapore och USA. Platinabaserad kemoterapi är för närvarande stöttepelaren i läkemedelsbehandling för lungcancerpatienter även om den endast lindrar sjukdomsrelaterade symtom tillfälligt. Nyligen har användningen av molekylärt riktad terapi lett till förbättrad överlevnad hos undergrupper av patienter. Särskilt förekomsten av EGFR- eller ALK-mutationer från lungbiopsier förutsäger förbättrad svarshastighet och progressionsfri överlevnad från användning av tyrosinkinashämmare respektive crizotinib. Viktigt är att EGFR-mutationer är vanligare i tumörer hos asiatiska patienter (cirka 35 %) jämfört med icke-asiater (cirka 10 %).

Den främsta dödsorsaken hos patienter med solid cancer är metastaser från spridning via blodcirkulationen. Förmågan att upptäcka förekomsten av tumörceller i cirkulationen redan innan öppna metastaser inträffar har utvecklats snabbt de senaste åren. Den prognostiska betydelsen av cirkulerande tumör-DNA (ctDNA) och cirkulerande tumörceller (CTC) i flera cancerformer har upptäckts och denna teknik är allmänt erkänd för att vara av stor klinisk och biologisk betydelse. Denna studie utvärderar användningen av ctDNA och CTC för att förutsäga sjukdomsaktivitet och läkemedelssvar hos lungcancerpatienter och tjänar till att komplettera befintliga metoder för att uppnå ett icke-invasivt och korrekt sätt att vägleda behandlingsbeslut.

Faktum är att användningen av ctDNA och CTC som markör för riskbedömning och behandlingsövervakning är fördelaktig eftersom den är tillgänglig kan övervakas regelbundet på en icke-invasiv basis. Detta kommer att bättre skräddarsy våra övervakningsprogram och behandlingar för att optimera sjukdomsutfall.

Utredarna har utvecklat ett EGFR-mutationsdetektionskit som detekterar de tre huvudsakliga EGFR-mutationerna på ultrakänsliga nivåer. Utredarna har tillämpat detta på en mängd olika kliniska material, inklusive formalinfixerat paraffininbäddat DNA, pleurautgjutning, cirkulerande DNA samt cirkulerande tumörceller och funnit att kiten kan plocka upp dessa mutationer med hög känslighet och specificitet.

En mikrosilmembranfilteranordning för att effektivt isolera cirkulerande tumörceller från helblodsprov har utvecklats av Institute of Bioengineering and Nanotechnology. Enheten utnyttjar storleksskillnaden mellan cancerceller och blodceller för att uppnå cancercellinfångningen på ett mikrosiktfilter med > 85 % återhämtning från 4,5 ml helblod inom 10 minuter, visat med cancerceller spikade i helblodsprover. Enheten innehåller ett tätt packat porsystem (> 8000 porer/mm^2) med en optimerad pordiameter på 10 µm. Vätskereglering och cellräkning uppnås genom ett enkelt vakuumpumpning och laboratoriefluorescensmikroskop. De fångade cellerna färgas med anti-EpCAM-PE för CTC, anti-CD45-FITC för vita blodkroppar och 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) för cellkärnor. CTC:erna identifieras med anti-EpCAM-positiva, anti-CD45-negativa och DAPI-positiva, karakteriserade med ett fluorescensmikroskop.

Därför, från våra preliminära studier, antar utredarna att vår teknologi är användbar för att isolera cirkulerande tumörceller och att dessa cirkulerande tumörceller sannolikt korrelerar med sjukdomsaktivitet och inte finns hos hälsoindivider.

Övervakningen av cirkulerande tumör-DNA och cirkulerande tumörceller kan ge en kliniskt värdefull ledtid för att bestämma svar, jämfört med konventionella radiologiska metoder.

En kohort patienter kommer att rekryteras för en longitudinell kohortstudie där vävnad och blod samlas in för biomarkörer. Inget ingripande är tänkt. Studien kommer att genomföras under tre år.

Patientprov och samtycke

Prospektivt över sex år (augusti 2014 till augusti 2020) kommer cirka 150 patienter som diagnostiserats med lungcancer som ger fullt informerat samtycke till denna studie att få tumör och/eller blod och/eller utgjutningar insamlade. Patienter från andra platser kan remitteras till dessa platser.

Om patienter inte samtycker till insamling av blod för kliniska studier men har samtyckt till och undertecknat informerat operativt samtycke för insamling av fryst eller formalinfixerat paraffininbäddat material för forskningsändamål inklusive biopsier, cytologi eller kirurgiska resektioner som en del av standardformuläret för kirurgiskt samtycke, tumörvävnad och normal vävnad kommer att samlas in från Changi General Hospital. Tumörstadieindelning och gradering erhölls från granskning av patologirapporterna och utvärdering av fallanteckningarna av individuella klinikutredare. Skriftligt informerat samtycke för analys av prospektivt insamlade kliniska prov kommer att erhållas från alla patienter, inklusive samtycke till att erhålla ett biopsi-lungvävnadsprov för forskningsändamål. Inga andra ytterligare ingrepp behövs förutom den rekommenderade proceduren för att ta bort patientens vävnad för bedömning av tumören, vare sig det är bronkoskopi, CT-vägd biopsi eller öppen kirurgi, beroende på läkarens bedömning. När rutinproceduren är klar kommer en av vävnaderna att väljas ut för forskningsändamål. "Forskningsvävnadsblocken" kommer att anonymiseras och objektglasen satsas för efterföljande undersökning/verifiering av tumörnärvaro av en patolog.

Varje blivande patient kommer att ge baseline 3 EDTA-rör med blod (totalt cirka 30 ml). Urin (~100mL) kommer att samlas in samtidigt för studier av urin-DNA.

Dessa blodprover kommer att centrifugeras i 10 minuter vid 3000 rpm, för insamling av serum och plasma för validering av biomarkörer som identifierats genom mikroarrayanalys, och väljs för kandidatutsöndrade proteiner i blodet.

Utgjutningar (pleurala eller peritoneala) kommer att erhållas som en del av rutinmässiga terapeutiska procedurer som rekommenderas av den behandlande läkaren, där vätskorna annars skulle ha kasserats. Vid ingen tidpunkt kommer effusionsvätska att erhållas för det enda syftet med denna studie.

Nedströms arbete i termer av utvärdering av CTCs, perifera mononukleära blodceller, DNA, RNA, protein och andra genetiska och molekylära material kommer att utföras. Tekniker som tillämpas kommer att omfatta kvantitativ PCR, sekvensering, flödescytometri och immunfenotypning, immunhistokemi, fluorescerande in situ-hybridisering, odling, etc.

Mutationsanalys:

Genetiskt material kommer att extraheras från 3-5 ml material som fångas på sikt och från blodplasma, samt relevant material som utgjutningar eller urin. Detta kommer att analyseras med kvantitativ PCR med hjälp av specialdesignade primers och/eller sekvensering. Genetiska material kommer också att profileras med hjälp av nästa generations sekvenseringstekniker för att identifiera kliniskt verkningsbara mutationer som BRAF, ALK, ROS, RET, etc.

Proverna kommer att bearbetas färska. Eventuellt kvarvarande prov kommer att separeras i buffy coats och plasma och lagras i flytande kväve och/eller -80C.

Data och prover avidentifieras för laboratoriebehandling. Varje plats kommer att behålla information som länkar patienten till provet. Detta är nödvändigt för att fastställa uppföljningen.

Identifierade data kommer att finnas på en nätverksansluten PC, fysiskt placerad på Changi General Hospital och bakom institutionella brandväggar. Individuellt identifierbar data kommer att lagras på sjukhuset och kommer inte att delas med laboratoriet.

Uppgifterna kommer att arkiveras för nedströmsprojekt när studien är klar.