Een uitgebreide evaluatie van circulerend tumor-DNA en circulerende tumorcellen als voorspellende marker bij longkanker

Longkanker staat niet alleen in de top 3 van meest voorkomende soorten kanker bij zowel mannen als vrouwen, maar is ook de belangrijkste doodsoorzaak door kanker in Singapore en de Verenigde Staten. Op platina gebaseerde chemotherapie is momenteel de steunpilaar in de medicamenteuze behandeling van longkankerpatiënten, hoewel het ziektegerelateerde symptomen slechts tijdelijk verlicht. Onlangs heeft het gebruik van moleculair gerichte therapie geleid tot verbeterde overleving in subgroepen van patiënten. Met name de aanwezigheid van EGFR- of ALK-mutaties uit longbiopten voorspelt een verbeterd responspercentage en progressievrije overleving door het gebruik van respectievelijk tyrosinekinaseremmers of crizotinib. Belangrijk is dat EGFR-mutaties vaker voorkomen bij tumoren van Aziatische patiënten (ongeveer 35%) versus niet-Aziaten (ongeveer 10%).

De belangrijkste doodsoorzaak bij patiënten met solide kankers zijn metastasen door verspreiding via de bloedsomloop. Het vermogen om de aanwezigheid van tumorcellen in de bloedsomloop te detecteren, zelfs voordat openlijke metastasen optreden, is de afgelopen jaren snel geëvolueerd. Het prognostische belang van circulerend tumor-DNA (ctDNA) en circulerende tumorcellen (CTC's) bij verschillende vormen van kanker is gevonden en algemeen wordt erkend dat deze techniek van groot klinisch en biologisch belang is. Deze studie evalueert het gebruik van ctDNA en CTC's bij het voorspellen van ziekteactiviteit en geneesmiddelrespons bij longkankerpatiënten en dient als aanvulling op bestaande methoden om een ​​niet-invasieve en nauwkeurige manier te bereiken om behandelbeslissingen te sturen.

Het gebruik van ctDNA en CTC's als marker voor risicobeoordeling en behandelingsmonitoring is inderdaad voordelig omdat het toegankelijk is en regelmatig op niet-invasieve basis kan worden gecontroleerd. Dit zal onze bewakingsprogramma's en behandeling beter afstemmen om de ziekteresultaten te optimaliseren.

De onderzoekers hebben een EGFR-mutatiedetectiekit ontwikkeld die de 3 belangrijkste EGFR-mutaties op ultragevoelige niveaus detecteert. De onderzoekers hebben dit toegepast op een verscheidenheid aan klinische materialen, waaronder formaline-gefixeerd in paraffine ingebed DNA, pleurale effusies, circulerend DNA en circulerende tumorcellen en ontdekten dat de kits deze mutaties met hoge gevoeligheid en specificiteit kunnen oppikken.

Een microzeefmembraanfilterapparaat om circulerende tumorcellen effectief te isoleren uit volbloedmonsters is ontwikkeld door het Institute of Bioengineering and Nanotechnology. Het apparaat maakt gebruik van het verschil in grootte tussen kankercellen en bloedcellen om kankercellen te vangen op een microzeeffilter met > 85% herstelpercentage van 4,5 ml volbloed binnen 10 minuten, aangetoond met kankercellen verrijkt met volbloedmonsters. Het apparaat bevat een dicht opeengepakte poriereeks (> 8000 poriën/mm^2) met een geoptimaliseerde poriediameter van 10 µm. Vloeistofregulatie en celtelling worden bereikt door een eenvoudig vacuümpompen en laboratoriumfluorescentiemicroscoop. De gevangen cellen worden gekleurd met anti-EpCAM-PE voor CTC's, anti-CD45-FITC voor witte bloedcellen en 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) voor celkernen. De CTC's worden geïdentificeerd met anti-EpCAM-positief, anti-CD45-negatief en DAPI-positief, gekarakteriseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Vandaar dat de onderzoekers op basis van onze voorlopige studies veronderstellen dat onze technologie nuttig is voor het isoleren van circulerende tumorcellen en dat deze circulerende tumorcellen waarschijnlijk correleren met ziekteactiviteit en niet worden aangetroffen bij gezonde personen.

De monitoring van circulerend tumor-DNA en circulerende tumorcellen kan een klinisch waardevolle aanlooptijd bieden bij het bepalen van de respons, in vergelijking met conventionele radiologische methoden.

Een cohort van patiënten zal worden aangeworven voor een longitudinaal cohortonderzoek waarbij weefsel en bloed worden verzameld voor biomarkers. Er is geen tussenkomst voorzien. Het onderzoek zal over drie jaar worden uitgevoerd.

Patiëntmonsters en toestemming

Over een periode van zes jaar (augustus 2014 tot augustus 2020) zullen bij ongeveer 150 patiënten met de diagnose longkanker die volledige geïnformeerde toestemming geven voor deze studie tumor en/of bloed en/of effusies worden afgenomen. Patiënten van andere locaties kunnen naar deze sites worden doorverwezen.

Als patiënten geen toestemming geven voor bloedafname voor klinische studies, maar toestemming hebben gegeven en geïnformeerde operatieve toestemming hebben ondertekend voor het verzamelen van bevroren of formaline-gefixeerd in paraffine ingebed materiaal voor onderzoeksdoeleinden, waaronder biopsieën, cytologie of chirurgische resecties als onderdeel van het standaard chirurgische toestemmingsformulier, tumorweefsel en normaal weefsel zullen worden verzameld bij het Changi General Hospital. Tumorstadiëring en -classificatie werden verkregen uit beoordeling van de pathologierapporten en evaluatie van de casusaantekeningen door individuele klinische onderzoekers. Schriftelijke geïnformeerde toestemming voor analyse van prospectief verzamelde klinische monsters zal worden verkregen van alle patiënten, inclusief de toestemming voor het verkrijgen van een biopsie van longweefsel voor onderzoeksdoeleinden. Er zijn geen andere aanvullende procedures nodig dan de aanbevolen procedure om het weefsel van de patiënt te verwijderen voor beoordeling van de tumor, of het nu gaat om bronchoscopie, CT-geleide biopsie of open chirurgie, afhankelijk van de beoordeling van de arts. Zodra de routineprocedure is voltooid, wordt een van de weefsels geselecteerd voor onderzoeksdoeleinden. De "onderzoeksweefselblokken" worden geanonimiseerd en de objectglaasjes worden gegroepeerd voor later onderzoek/verificatie van de aanwezigheid van de tumor door een patholoog.

Elke toekomstige patiënt zal basislijn 3 EDTA-buisjes bloed leveren (totaal ongeveer 30 ml). Urine (~ 100 ml) wordt tegelijkertijd verzameld voor onderzoek van urine-DNA.

Deze bloedmonsters worden gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 3000 rpm, voor het verzamelen van serum en plasma voor validatie van biomarkers geïdentificeerd door microarray-analyse, waarbij wordt geselecteerd op kandidaat-uitgescheiden eiwitten in het bloed.

Effusies (pleuraal of peritoneaal) zullen worden verkregen als onderdeel van routinematige therapeutische procedures zoals aanbevolen door de behandelend arts, waarbij de vloeistoffen anders zouden zijn weggegooid. Er zal op geen enkel moment effusievloeistof worden verkregen voor het enige doel van dit onderzoek.

Stroomafwaarts zullen er werkzaamheden worden uitgevoerd in termen van evaluatie van de CTC's, perifere mononucleaire bloedcellen, DNA, RNA, eiwitten en andere genetische en moleculaire materialen. Toegepaste technieken omvatten kwantitatieve PCR, sequencing, flowcytometrie en immunofenotypering, immunohistochemie, fluorescerende in situ-hybridisatie, cultuur, enz.

Mutatie-analyse:

Genetisch materiaal zal worden geëxtraheerd uit 3-5 ml materiaal dat op een zeef is gevangen en uit bloedplasma, evenals relevant materiaal zoals effusies of urine. Dit zal worden geanalyseerd door middel van kwantitatieve PCR met behulp van speciaal ontworpen primers en/of sequencing. Genetisch materiaal zal ook worden geprofileerd met behulp van sequentiëringstechnieken van de volgende generatie om klinisch bruikbare mutaties te identificeren, zoals BRAF, ALK, ROS, RET, enz.

Monsters worden vers verwerkt. Het resterende monster wordt gescheiden in buffy coats en plasma en opgeslagen in vloeibare stikstof en/of -80C.

Gegevens en monsters worden geanonimiseerd voor verwerking in het laboratorium. Elke site bewaart informatie die de patiënt aan het monster koppelt. Dit is nodig voor het bepalen van de follow-up.

Geïdentificeerde gegevens bevinden zich op een pc in een netwerk, fysiek gelokaliseerd in het Changi General Hospital en achter institutionele firewalls. Individueel identificeerbare gegevens worden bewaard in het ziekenhuis en worden niet gedeeld met het laboratorium.

De gegevens worden gearchiveerd voor downstream-projecten zodra het onderzoek is voltooid.