循环肿瘤DNA和循环肿瘤细胞作为肺癌预测标志物的综合评价

肺癌不仅是男性和女性中最常见的三种癌症类型之一，而且还是新加坡和美国癌症死亡率的主要原因。 铂类化疗是目前肺癌患者药物治疗的主要药物，虽然它只能暂时缓解疾病相关症状。 最近，分子靶向治疗的使用提高了部分患者的生存率。 特别是，肺活检中 EGFR 或 ALK 突变的存在预示着分别使用酪氨酸激酶抑制剂或克唑替尼可提高反应率和无进展生存期。 重要的是，与非亚洲人（约 10%）相比，EGFR 突变在亚洲患者（约 35%）的肿瘤中更为常见。

实体癌患者死亡的主要原因是通过血液循环传播的转移。 甚至在明显转移发生之前检测循环中肿瘤细胞存在的能力近年来发展迅速。 已经发现循环肿瘤 DNA (ctDNA) 和循环肿瘤细胞 (CTC) 在几种癌症中的预后重要性，并且该技术被广泛认为具有重要的临床和生物学重要性。 本研究评估了 ctDNA 和 CTC 在预测肺癌患者的疾病活动和药物反应中的用途，并用于补充现有方法以实现非侵入性和准确的方法来指导治疗决策。

事实上，使用 ctDNA 和 CTC 作为风险评估和治疗监测的标记物是有利的，因为它可以在非侵入性的基础上定期监测。 这将更好地调整我们的监测计划和治疗以优化疾病结果。

研究人员开发了一种 EGFR 突变检测试剂盒，可以在超灵敏水平上检测 3 种主要的 EGFR 突变。 研究人员已将其应用于多种临床材料，包括福尔马林固定石蜡包埋的 DNA、胸腔积液、循环 DNA 以及循环肿瘤细胞，并发现该试剂盒能够以高灵敏度和特异性检测这些突变。

生物工程与纳米技术研究所开发了一种微筛膜过滤装置，可有效分离全血样本中的循环肿瘤细胞。 该设备利用癌细胞和血细胞之间的大小差异，在微筛过滤器上实现癌细胞捕获，在 10 分钟内从 4.5 毫升全血中回收率 > 85%，通过将癌细胞掺入全血样本来证明。 该设备包含一个密集的孔阵列（> 8000 个孔/mm^2），优化的孔径为 10 µm。 流体调节和细胞计数是通过简单的真空泵和实验室荧光显微镜实现的。 捕获的细胞用针对 CTC 的抗 EpCAM-PE、针对白细胞的抗 CD45-FITC 和针对细胞核的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色。 CTC 被鉴定为抗 EpCAM 阳性、抗 CD45 阴性和 DAPI 阳性，使用荧光显微镜表征。

因此，根据我们的初步研究，研究人员假设我们的技术可用于分离循环肿瘤细胞，并且这些循环肿瘤细胞可能与疾病活动相关，并且在健康个体中未发现。

与传统的放射学方法相比，循环肿瘤 DNA 和循环肿瘤细胞的监测可以为确定反应提供具有临床价值的前置时间。

将招募一组患者进行纵向队列研究，收集组织和血液作为生物标志物。 没有干预的设想。 该研究将进行三年。

患者样本和同意书

前瞻性超过六年（2014 年 8 月至 2020 年 8 月），约 150 名被诊断为肺癌且对本研究提供完全知情同意的患者将收集肿瘤和/或血液和/或积液。 来自其他地方的患者可能会被转介到这些站点。

如果患者不同意为临床研究采集血液，但已同意并签署知情手术同意书，以收集冷冻或福尔马林固定石蜡包埋材料用于研究目的，包括作为标准手术同意书的一部分的活检、细胞学或手术切除，将从樟宜综合医院收集肿瘤组织和正常组织。 肿瘤分期和分级是从病理报告的审查和个别临床医生研究者对病例记录的评估中获得的。 将从所有患者处获得对前瞻性收集的临床样本进行分析的书面知情同意书，包括同意获得用于研究目的的活检肺组织标本。 除了根据医生的评估，采用支气管镜检查、CT 引导的活检或开放手术，除了推荐的移除患者组织以评估肿瘤的程序外，不需要其他额外程序。 常规程序完成后，将选择其中一个组织用于研究目的。 “研究组织块”将被匿名化，载玻片将被分批处理，以供病理学家对肿瘤存在进行后续检查/验证。

每个预期患者将提供基线 3 EDTA 血液管（总共约 30 毫升）。 将同时收集尿液 (~100mL) 用于尿液 DNA 研究。

这些血液样本将以 3000 rpm 的速度离心 10 分钟，以收集血清和血浆，以验证通过微阵列分析识别的生物标志物，选择血液中的候选分泌蛋白。

积液（胸膜或腹膜）将作为治疗临床医生推荐的常规治疗程序的一部分获得，否则液体将被丢弃。 在任何时候都不会为了本研究的唯一目的而获得渗出液。

将进行 CTC、外周血单核细胞、DNA、RNA、蛋白质和其他遗传和分子材料评估方面的下游工作。 应用的技术将包括定量 PCR、测序、流式细胞术和免疫分型、免疫组织化学、荧光原位杂交、培养等。

突变分析：

遗传物质将从截留在筛子上的 3-5 mL 材料和血浆以及相关材料（例如积液或尿液）中提取。 这将使用定制设计的引物和/或测序通过定量 PCR 进行分析。 还将使用下一代测序技术对遗传材料进行分析，以确定临床上可操作的突变，如 BRAF、ALK、ROS、RET 等。

样品将被新鲜处理。 任何剩余的样品将被分离成血沉棕黄层和血浆，并储存在液氮和/或 -80C 中。

数据和标本被取消识别以供实验室处理。 每个站点都将保留将患者与标本联系起来的信息。 这对于确定后续行动是必要的。

已识别的数据将位于联网的 PC 上，该 PC 实际位于樟宜综合医院并位于机构防火墙后面。 可识别个人身份的数据将保留在医院中，不会与实验室共享。

一旦研究完成，数据将被归档用于下游项目。