En omfattende evaluering av sirkulerende tumor-DNA og sirkulerende tumorceller som en prediktiv markør i lungekreft

Lungekreft er ikke bare blant de tre mest vanlige krefttypene hos både menn og kvinner, men også den viktigste årsaken til kreftdødelighet i Singapore og USA. Platinabasert kjemoterapi er for tiden bærebjelken i medikamentell behandling for lungekreftpasienter, selv om den bare lindrer sykdomsrelaterte symptomer midlertidig. Nylig har bruken av molekylært målrettet terapi ført til forbedret overlevelse hos undergrupper av pasienter. Spesielt forutsier tilstedeværelsen av EGFR- eller ALK-mutasjoner fra lungebiopsier forbedret responsrate og progresjonsfri overlevelse fra bruk av henholdsvis tyrosinkinasehemmere eller crizotinib. Viktigere er at EGFR-mutasjoner er mer vanlige i svulster hos asiatiske pasienter (ca. 35 %) sammenlignet med ikke-asiater (ca. 10 %).

Hovedårsaken til dødelighet hos pasienter med solide kreftformer er metastaser fra spredning via blodsirkulasjonen. Evnen til å oppdage tilstedeværelsen av tumorceller i sirkulasjonen selv før åpenbare metastaser oppstår har utviklet seg raskt de siste årene. Den prognostiske betydningen av sirkulerende tumor-DNA (ctDNA) og sirkulerende tumorceller (CTC) i flere kreftformer er funnet, og denne teknikken er allment anerkjent for å være av stor klinisk og biologisk betydning. Denne studien evaluerer bruken av ctDNA og CTC for å forutsi sykdomsaktivitet og medikamentrespons hos lungekreftpasienter og tjener til å komplementere eksisterende metoder for å oppnå et ikke-invasivt og nøyaktig middel for å veilede behandlingsbeslutninger.

Faktisk er bruken av ctDNA og CTC-er som en markør for risikovurdering og behandlingsovervåking fordelaktig ettersom den er tilgjengelig og kan overvåkes regelmessig på en ikke-invasiv basis. Dette vil bedre skreddersy våre overvåkingsprogrammer og behandling for å optimalisere sykdomsutfall.

Etterforskerne har utviklet et EGFR-mutasjonsdeteksjonssett som oppdager de tre viktigste EGFR-mutasjonene på ultrasensitive nivåer. Etterforskerne har brukt dette på en rekke kliniske materialer, inkludert formalinfiksert parafininnstøpt DNA, pleural effusjoner, sirkulerende DNA samt sirkulerende tumorceller og funnet ut at settene kan fange opp disse mutasjonene med høy sensitivitet og spesifisitet.

En mikrosilmembranfilterenhet for effektivt å isolere sirkulerende tumorceller fra fullblodprøver er utviklet av Institute of Bioengineering and Nanotechnology. Enheten utnytter størrelsesforskjellen mellom kreftceller og blodceller for å oppnå kreftcellefangst på et mikrosilfilter med > 85 % utvinningsgrad fra 4,5 ml fullblod i løpet av 10 minutter, demonstrert med kreftceller tilsatt fullblodprøver. Enheten inneholder en tettpakket porearray (> 8000 porer/mm^2) med en optimalisert porediameter på 10 µm. Væskeregulering og celletelling oppnås ved et enkelt vakuumpumping og laboratoriefluorescensmikroskop. De fangede cellene farges med anti-EpCAM-PE for CTC, anti-CD45-FITC for hvite blodceller og 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for cellekjerner. CTC-ene er identifisert med anti-EpCAM-positive, anti-CD45-negative og DAPI-positive, karakterisert ved bruk av et fluorescensmikroskop.

Derfor, fra våre foreløpige studier, antar etterforskerne at teknologien vår er nyttig for å isolere sirkulerende tumorceller og at disse sirkulerende tumorcellene sannsynligvis korrelerer med sykdomsaktivitet og ikke finnes hos helsepersoner.

Overvåking av sirkulerende tumor-DNA og sirkulerende tumorceller kan gi en klinisk verdifull ledetid for å bestemme respons, sammenlignet med konvensjonelle radiologiske metoder.

En kohort med pasienter vil bli rekruttert til en longitudinell kohortstudie hvor vev og blod samles inn for biomarkører. Det er ikke tenkt inngrep. Studien skal gjennomføres over tre år.

Pasientprøver og samtykke

Prospektivt over seks år (august 2014 til august 2020), vil ca. 150 pasienter diagnostisert med lungekreft som gir fullt informert samtykke til denne studien få svulst og/eller blod og/eller effusjoner. Pasienter fra andre steder kan bli henvist til disse stedene.

Hvis pasienter ikke samtykker til innsamling av blod for kliniske studier, men har samtykket og signert informert operativt samtykke for innsamling av frosset eller formalinfiksert parafininnstøpt materiale for forskningsformål, inkludert biopsier, cytologi eller kirurgiske reseksjoner som en del av standard kirurgisk samtykkeskjema, tumorvev og normalt vev vil bli samlet inn fra Changi General Hospital. Tumorstadieinndeling og -gradering ble oppnådd fra gjennomgang av patologirapportene og evaluering av saksnotatene av individuelle klinikere. Skriftlig informert samtykke for analyse av prospektivt innsamlede kliniske prøver vil bli innhentet fra alle pasienter, inkludert samtykke til å ta en biopsi lungevevsprøve for forskningsformål. Ingen andre tilleggsprosedyrer er nødvendig enn den anbefalte prosedyren for å fjerne pasientens vev for vurdering av svulsten, det være seg bronkoskopi, CT-veiledet biopsi eller åpen kirurgi, avhengig av legens vurdering. Når rutineprosedyren er fullført, vil ett av vevene bli valgt for forskningsformål. "Forskningsvevsblokkene" vil anonymiseres og objektglassene settes sammen for påfølgende undersøkelse/verifisering av tumortilstedeværelse av en patolog.

Hver potensiell pasient vil gi baseline 3 EDTA-rør med blod (totalt ca. 30 ml). Urin (~100 ml) vil bli samlet inn samtidig for studier av urin-DNA.

Disse blodprøvene vil bli sentrifugert i 10 minutter ved 3000 rpm, for innsamling av serum og plasma for validering av biomarkører identifisert ved mikroarray-analyse, og velges for kandidatutskilte proteiner i blodet.

Effusjoner (pleural eller peritoneal) vil bli oppnådd som en del av rutinemessige terapeutiske prosedyrer som anbefalt av behandlende kliniker, der væskene ellers ville blitt kastet. Det vil ikke på noe tidspunkt oppnås effusjonsvæske for det eneste formålet med denne studien.

Nedstrøms arbeid i form av evaluering av CTC-ene, mononukleære celler fra perifert blod, DNA, RNA, protein og andre genetiske og molekylære materialer vil bli utført. Teknikker som brukes vil omfatte kvantitativ PCR, sekvensering, flowcytometri og immunfenotyping, immunhistokjemi, fluorescerende in situ-hybridisering, kultur, etc.

Mutasjonsanalyse:

Genetisk materiale vil bli ekstrahert fra 3-5 mL av materialer fanget på sil og fra blodplasma, samt relevant materiale som effusjoner eller urin. Dette vil bli analysert ved kvantitativ PCR ved bruk av spesialdesignede primere og/eller sekvensering. Genetiske materialer vil også bli profilert ved bruk av neste generasjons sekvenseringsteknikker for å identifisere klinisk handlingsbare mutasjoner som BRAF, ALK, ROS, RET, etc.

Prøver vil bli behandlet ferske. Eventuell gjenværende prøve vil bli separert i buffy coats og plasma og lagret i flytende nitrogen og/eller -80C.

Data og prøver er avidentifisert for laboratoriebehandling. Hvert nettsted vil beholde informasjon som knytter pasienten til prøven. Dette er nødvendig for fastsettelse av oppfølging.

Identifiserte data vil bli plassert på en nettverkstilkoblet PC, fysisk plassert i Changi General Hospital og bak institusjonelle brannmurer. Individuelt identifiserbare data vil bli oppbevart på sykehuset og vil ikke bli delt med laboratoriet.

Dataene vil bli arkivert for nedstrømsprosjekter når studien er fullført.