폐암의 예측 표지자로서 순환종양 DNA와 순환종양세포의 종합적 평가

폐암은 남성과 여성 모두에서 가장 흔한 3대 암 유형에 속할 뿐만 아니라 싱가포르와 미국에서 암 사망률의 주요 원인이기도 합니다. 백금 기반 화학 요법은 질병 관련 증상을 일시적으로 완화시킬 뿐이지 만 현재 폐암 환자의 약물 치료의 주류입니다. 최근 분자 표적 치료법을 사용하여 일부 환자의 생존율이 향상되었습니다. 특히, 폐 생검으로부터의 EGFR 또는 ALK 돌연변이의 존재는 각각 티로신 키나제 억제제 또는 크리조티닙의 사용으로부터 개선된 반응률 및 무진행 생존을 예측한다. 중요하게도 EGFR 돌연변이는 비아시아인(약 10%)에 비해 아시아인(약 35%)의 종양에서 더 흔합니다.

고형암 환자의 주요 사망 원인은 혈액 순환을 통한 파종으로 인한 전이입니다. 명백한 전이가 발생하기 전에도 순환계에서 종양 세포의 존재를 감지하는 능력은 최근 몇 년 동안 급속도로 발전했습니다. 여러 암에서 순환 종양 DNA(ctDNA) 및 순환 종양 세포(CTC)의 예후적 중요성이 발견되었으며 이 기술은 주요 임상 및 생물학적 중요성으로 널리 인식되고 있습니다. 이 연구는 폐암 환자의 질병 활동 및 약물 반응을 예측하는 데 ctDNA 및 CTC의 사용을 평가하고 치료 결정을 안내하는 비침습적이고 정확한 수단을 달성하기 위해 기존 방법을 보완하는 역할을 합니다.

실제로 위험 평가 및 치료 모니터링을 위한 마커로 ctDNA 및 CTC를 사용하는 것은 비침습적으로 정기적으로 모니터링할 수 있기 때문에 유리합니다. 이것은 우리의 감시 프로그램과 치료를 더 잘 조정하여 질병 결과를 최적화할 것입니다.

연구자들은 매우 민감한 수준에서 3개의 주요 EGFR 돌연변이를 검출하는 EGFR 돌연변이 검출 키트를 개발했습니다. 연구자들은 이를 포르말린 고정 파라핀 포매 DNA, 흉막 삼출물, 순환 DNA 및 순환 종양 세포를 포함한 다양한 임상 재료에 적용했으며 키트가 높은 민감도와 특이도로 이러한 돌연변이를 선택할 수 있음을 발견했습니다.

전혈 샘플에서 순환하는 종양 세포를 효과적으로 분리하기 위한 마이크로시브 멤브레인 필터 장치가 생명공학 및 나노기술 연구소에서 개발되었습니다. 이 장치는 암세포와 혈액 세포 사이의 크기 차이를 이용하여 10분 이내에 4.5ml 전혈에서 85% 이상의 회수율로 마이크로체 필터에서 암세포 포획을 달성하며, 암세포가 전혈 샘플에 첨가된 것으로 입증되었습니다. 이 장치는 10µm의 최적화된 기공 직경을 가진 조밀하게 채워진 기공 어레이(> 8000개 기공/mm^2)를 포함합니다. 유체 조절 및 세포 계수는 간단한 진공 펌핑 및 실험실 형광 현미경으로 이루어집니다. 포획된 세포는 CTC의 경우 항EpCAM-PE, 백혈구의 경우 항CD45-FITC, 세포핵의 경우 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 염색됩니다. CTC는 항-EpCAM 양성, 항-CD45 음성 및 DAPI 양성으로 식별되며 형광 현미경을 사용하여 특성화됩니다.

따라서 우리의 예비 연구에서 연구자들은 우리의 기술이 순환하는 종양 세포를 분리하는 데 유용하고 이러한 순환하는 종양 세포가 질병 활동과 관련이 있을 가능성이 있으며 건강한 개인에서는 발견되지 않는다는 가설을 세웠습니다.

순환하는 종양 DNA 및 순환하는 종양 세포의 모니터링은 기존의 방사선학적 방법과 비교하여 반응을 결정하는 데 있어 임상적으로 가치 있는 리드 타임을 제공할 수 있습니다.

바이오마커를 위해 조직과 혈액을 수집하는 종적 코호트 연구를 위해 환자 코호트를 모집합니다. 어떤 개입도 계획되지 않습니다. 연구는 3년에 걸쳐 진행될 예정이다.

환자 샘플 및 동의

전향적으로 6년 동안(2014년 8월부터 2020년 8월까지) 폐암 진단을 받고 본 연구에 동의한 약 150명의 환자를 대상으로 종양 및/또는 혈액 및/또는 삼출액을 수집할 것입니다. 다른 위치의 환자는 이러한 사이트를 참조할 수 있습니다.

환자가 임상 연구를 위한 혈액 수집에 동의하지 않았지만 표준 외과 동의서 양식의 일부로 생검, 세포학 또는 수술 절제술을 포함한 연구 목적을 위한 동결 또는 포르말린 고정 파라핀 포매 물질의 수집에 대해 정보에 입각한 수술 동의서에 동의하고 서명한 경우, 종양 조직 및 정상 조직은 창이 종합 병원에서 수집됩니다. 종양 병기 및 등급은 병리학 보고서 검토 및 개별 임상 조사관의 증례 기록 평가를 통해 얻었습니다. 전향적으로 수집된 임상 샘플의 분석에 대한 서면 동의서는 연구 목적을 위한 생검 폐 조직 표본을 얻기 위한 동의를 포함하여 모든 환자로부터 얻을 것입니다. 의사의 평가에 따라 기관지경 검사, CT 유도 생검 또는 개복 수술 등 종양 평가를 위해 환자의 조직을 제거하기 위해 권장되는 절차 외에 다른 추가 절차는 필요하지 않습니다. 일상적인 절차가 완료되면 조직 중 하나가 연구 목적으로 선택됩니다. "연구 조직 블록"은 익명으로 처리되고 슬라이드는 병리학자에 의한 종양 존재의 후속 검사/확인을 위해 일괄 처리됩니다.

각 예비 환자는 기준선 3개의 EDTA 혈액 튜브(총 약 30ml)를 제공합니다. 소변 DNA 연구를 위해 소변(~100mL)을 동시에 수집합니다.

이들 혈액 샘플은 마이크로어레이 분석에 의해 확인된 바이오마커의 검증을 위한 혈청 및 혈장 수집을 위해 3000rpm에서 10분 동안 원심분리되어 혈액에서 분비된 후보 단백질을 선택합니다.

삼출액(흉막 또는 복막)은 치료하는 임상의가 권장하는 대로 일상적인 치료 절차의 일부로 채취되며, 그렇지 않으면 수액이 폐기되었을 것입니다. 어떤 시점에서도 이 연구의 유일한 목적을 위해 삼출액을 얻지 못할 것입니다.

CTC, 말초 혈액 단핵 세포, DNA, RNA, 단백질 및 기타 유전 및 분자 물질의 평가 측면에서 다운스트림 작업이 수행됩니다. 적용되는 기술에는 정량적 PCR, 시퀀싱, 유세포 분석 및 면역표현형 분석, 면역조직화학, 형광 in situ-하이브리드화, 배양 등이 포함됩니다.

돌연변이 분석:

체에 걸러진 3~5mL의 물질과 혈장, 삼출액, 소변 등 관련 물질에서 유전물질을 추출한다. 이는 맞춤 설계된 프라이머 및/또는 시퀀싱을 사용하여 정량적 PCR로 분석됩니다. 유전 물질은 BRAF, ALK, ROS, RET 등과 같이 임상적으로 실행 가능한 돌연변이를 식별하기 위해 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 프로파일링될 것입니다.

샘플은 신선하게 처리됩니다. 나머지 샘플은 버피 코트와 플라즈마로 분리되어 액체 질소 및/또는 -80C에 저장됩니다.

데이터와 표본은 실험실 처리를 위해 익명화됩니다. 각 사이트는 환자와 검체를 연결하는 정보를 보유합니다. 후속 조치를 결정하는 데 필요합니다.

식별된 데이터는 물리적으로 창이 종합 병원에 있고 기관 방화벽 뒤에 있는 네트워크 PC에 있습니다. 개별적으로 식별 가능한 데이터는 병원에 보관되며 실험실과 공유되지 않습니다.

연구가 완료되면 다운스트림 프로젝트를 위해 데이터가 보관됩니다.