Komplexní hodnocení cirkulující nádorové DNA a cirkulujících nádorových buněk jako prediktivního markeru u rakoviny plic

Rakovina plic patří nejen mezi 3 nejčastější typy rakoviny u mužů i žen, ale je také hlavní příčinou úmrtnosti na rakovinu v Singapuru a Spojených státech. Chemoterapie na bázi platiny je v současné době hlavním pilířem lékové léčby pacientů s rakovinou plic, i když pouze dočasně zmírňuje symptomy související s onemocněním. V poslední době vedlo použití molekulárně cílené terapie ke zlepšení přežití u podskupin pacientů. Zejména přítomnost mutací EGFR nebo ALK z plicních biopsií předpovídá zlepšenou míru odezvy a přežití bez progrese při použití inhibitorů tyrosinkinázy, respektive krizotinibu. Důležité je, že mutace EGFR jsou častější u nádorů asijských pacientů (asi 35 %) oproti neasijským pacientům (asi 10 %).

Hlavní příčinou úmrtnosti pacientů se solidními nádory jsou metastázy z diseminace krevním oběhem. Schopnost detekovat přítomnost nádorových buněk v oběhu ještě před vznikem zjevných metastáz se v posledních letech rychle vyvíjela. Byla zjištěna prognostická důležitost cirkulující nádorové DNA (ctDNA) a cirkulujících nádorových buněk (CTC) u několika rakovin a tato technika je široce uznávána jako zásadní klinický a biologický význam. Tato studie hodnotí použití ctDNA a CTC při predikci aktivity onemocnění a odpovědi na léky u pacientů s rakovinou plic a slouží k doplnění stávajících metod k dosažení neinvazivních a přesných prostředků pro rozhodování o léčbě.

Použití ctDNA a CTC jako markeru pro hodnocení rizik a monitorování léčby je skutečně výhodné, protože je dostupné a lze jej pravidelně sledovat na neinvazivním základě. To lépe přizpůsobí naše programy sledování a léčbu tak, aby byly optimalizovány výsledky onemocnění.

Vyšetřovatelé vyvinuli soupravu pro detekci mutace EGFR, která detekuje 3 hlavní mutace EGFR na ultrasenzitivních úrovních. Výzkumníci to aplikovali na různé klinické materiály včetně DNA zalité v parafínu fixovanou ve formalínu, pleurálních výpotků, cirkulující DNA i cirkulujících nádorových buněk a zjistili, že soupravy dokážou zachytit tyto mutace s vysokou citlivostí a specificitou.

Zařízení s mikrosítovým membránovým filtrem pro účinnou izolaci cirkulujících nádorových buněk ze vzorku plné krve bylo vyvinuto Institutem bioinženýrství a nanotechnologií. Zařízení využívá rozdílu ve velikosti mezi rakovinnými buňkami a krevními buňkami k dosažení zachycení rakovinných buněk na mikrosítovém filtru s > 85% mírou obnovy ze 4,5 ml plné krve během 10 minut, což bylo prokázáno rakovinnými buňkami přidanými do vzorků plné krve. Zařízení obsahuje hustě zaplněné pole pórů (> 8000 pórů/mm^2) s optimalizovaným průměrem pórů 10 µm. Regulace tekutin a počítání buněk je dosaženo jednoduchým vakuovým čerpadlem a laboratorním fluorescenčním mikroskopem. Zachycené buňky jsou obarveny anti-EpCAM-PE pro CTC, anti-CD45-FITC pro bílé krvinky a 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) pro buněčná jádra. CTC jsou identifikovány jako anti-EpCAM pozitivní, anti-CD45 negativní a DAPI pozitivní, charakterizovány pomocí fluorescenčního mikroskopu.

Z našich předběžných studií tedy vědci předpokládají, že naše technologie je užitečná pro izolaci cirkulujících nádorových buněk a že tyto cirkulující nádorové buňky pravděpodobně korelují s aktivitou onemocnění a nenacházejí se u zdravých jedinců.

Monitorování cirkulující nádorové DNA a cirkulujících nádorových buněk může poskytnout klinicky cenný čas na stanovení odpovědi ve srovnání s konvenčními radiologickými metodami.

Skupina pacientů bude přijata pro longitudinální kohortovou studii, kde se odebírají tkáň a krev pro biomarkery. Nepředpokládá se žádný zásah. Studie bude probíhat po dobu tří let.

Vzorky pacientů a souhlas

Prospektivně během šesti let (srpen 2014 až srpen 2020) bude asi 150 pacientům s diagnózou rakoviny plic, kteří poskytnou úplný informovaný souhlas s touto studií, odebrán nádor a/nebo krev a/nebo výpotek. Pacienti z jiných míst mohou být odkázáni na tyto stránky.

Pokud pacienti nesouhlasí s odběrem krve pro klinické studie, ale souhlasili a podepsali informovaný operační souhlas s odběrem zmrazeného nebo formalínem fixovaného parafínu zalitého materiálu pro výzkumné účely včetně biopsií, cytologie nebo chirurgických resekcí jako součást standardního formuláře chirurgického souhlasu, nádorová tkáň a normální tkáň budou odebrány z Changi General Hospital. Staging a klasifikace nádoru byly získány z přezkoumání patologických zpráv a vyhodnocení záznamů o případu jednotlivými klinickými vyšetřovateli. Od všech pacientů bude získán písemný informovaný souhlas s analýzou prospektivně odebraných klinických vzorků, včetně souhlasu se získáním bioptického vzorku plicní tkáně pro výzkumné účely. Nejsou potřeba žádné další další postupy kromě doporučeného postupu k odstranění pacientovy tkáně pro posouzení nádoru, ať už jde o bronchoskopii, biopsii pod CT nebo otevřenou operaci, v závislosti na posouzení lékaře. Po dokončení rutinního postupu bude jedna z tkání vybrána pro výzkumné účely. „Výzkumné tkáňové bloky“ budou anonymizovány a preparáty dávkovány pro následné vyšetření/ověření přítomnosti nádoru patologem.

Každý potenciální pacient poskytne základní 3 EDTA zkumavky krve (celkem přibližně 30 ml). Současně bude odebrána moč (~100 ml) pro studium DNA moči.

Tyto krevní vzorky budou centrifugovány po dobu 10 minut při 3000 ot./min., pro odběr séra a plazmy pro validaci biomarkerů identifikovaných mikročipovou analýzou, selekcí kandidátních secernovaných proteinů v krvi.

Výpotky (pleurální nebo peritoneální) budou získány jako součást rutinních terapeutických postupů podle doporučení ošetřujícího lékaře, kde by jinak byly tekutiny zlikvidovány. V žádném okamžiku nebude získávána výpotková tekutina pouze pro účely této studie.

Budou provedeny následné práce ve smyslu hodnocení CTC, mononukleárních buněk periferní krve, DNA, RNA, proteinů a dalších genetických a molekulárních materiálů. Použité techniky budou zahrnovat kvantitativní PCR, sekvenování, průtokovou cytometrii a imunofenotypizaci, imunohistochemii, fluorescenční in situ-hybridizaci, kultivaci atd.

Mutační analýza:

Genetický materiál bude extrahován z 3-5 ml materiálů zachycených na sítu a z krevní plazmy, stejně jako relevantní materiál, jako jsou výpotky nebo moč. To bude analyzováno pomocí kvantitativní PCR za použití zákaznicky navržených primerů a/nebo sekvenování. Genetické materiály budou také profilovány pomocí sekvenačních technik nové generace k identifikaci klinicky použitelných mutací, jako jsou BRAF, ALK, ROS, RET atd.

Vzorky budou zpracovány čerstvé. Veškerý zbývající vzorek bude rozdělen do leukocytů a plazmy a uložen v kapalném dusíku a/nebo -80C.

Data a vzorky jsou deidentifikace pro laboratorní zpracování. Každé místo bude uchovávat informace spojující pacienta se vzorkem. To je nezbytné pro stanovení následných opatření.

Identifikovaná data budou umístěna na síťovém PC, fyzicky umístěném v Changi General Hospital a za institucionálními firewally. Individuálně identifikovatelné údaje budou uchovávány v nemocnici a nebudou sdíleny s laboratoří.

Po dokončení studie budou data archivována pro následné projekty.