En omfattende evaluering af cirkulerende tumor-DNA og cirkulerende tumorceller som en prædiktiv markør i lungekræft

Lungekræft er ikke kun blandt de 3 mest almindelige kræfttyper hos både mænd og kvinder, men også den førende årsag til kræftdødelighed i Singapore og USA. Platinbaseret kemoterapi er i øjeblikket grundpillen i lægemiddelbehandling til lungekræftpatienter, selvom den kun lindrer sygdomsrelaterede symptomer midlertidigt. For nylig har brugen af ​​molekylært målrettet terapi ført til forbedret overlevelse hos undergrupper af patienter. Især forudsiger tilstedeværelsen af ​​EGFR- eller ALK-mutationer fra lungebiopsier forbedret responsrate og progressionsfri overlevelse fra brugen af ​​henholdsvis tyrosinkinasehæmmere eller crizotinib. Det er vigtigt, at EGFR-mutationer er mere almindelige i tumorer hos asiatiske patienter (ca. 35 %) i forhold til ikke-asiater (ca. 10 %).

Hovedårsagen til dødelighed hos patienter med solid cancer er metastaser fra spredning via blodcirkulationen. Evnen til at påvise tilstedeværelsen af ​​tumorceller i cirkulationen, selv før åbenlyse metastaser opstår, har udviklet sig hurtigt i de senere år. Den prognostiske betydning af cirkulerende tumor-DNA (ctDNA) og cirkulerende tumorceller (CTC'er) i flere kræftformer er blevet fundet, og denne teknik er almindeligt anerkendt for at være af stor klinisk og biologisk betydning. Denne undersøgelse evaluerer brugen af ​​ctDNA og CTC'er til at forudsige sygdomsaktivitet og lægemiddelrespons hos lungecancerpatienter og tjener til at supplere eksisterende metoder til at opnå et ikke-invasivt og præcist middel til at guide behandlingsbeslutninger.

Faktisk er brugen af ​​ctDNA og CTC'er som en markør for risikovurdering og behandlingsmonitorering fordelagtig, da den er tilgængelig, kan overvåges regelmæssigt på en ikke-invasiv basis. Dette vil bedre skræddersy vores overvågningsprogrammer og behandling for at optimere sygdomsudfald.

Efterforskerne har udviklet et EGFR-mutationsdetektionskit, der detekterer de 3 vigtigste EGFR-mutationer på ultrafølsomme niveauer. Efterforskerne har anvendt dette på en række kliniske materialer, herunder formalinfikseret paraffin-indlejret DNA, pleurale effusioner, cirkulerende DNA samt cirkulerende tumorceller og fundet ud af, at sættene kan opfange disse mutationer med høj sensitivitet og specificitet.

En mikrosigte membranfilteranordning til effektivt at isolere cirkulerende tumorceller fra fuldblodsprøver er blevet udviklet af Institute of Bioengineering and Nanotechnology. Enheden udnytter størrelsesforskellen mellem kræftceller og blodceller til at opnå kræftcelleindfangning på et mikrosigtefilter med > 85 % genvindingsgrad fra 4,5 ml fuldblod inden for 10 minutter, demonstreret med kræftceller tilsat fuldblodsprøver. Enheden indeholder et tætpakket porearray (> 8000 porer/mm^2) med en optimeret porediameter på 10 µm. Væskeregulering og celletælling opnås ved et simpelt vakuumpumpe- og laboratoriefluorescensmikroskop. De indfangede celler farves med anti-EpCAM-PE til CTC'er, anti-CD45-FITC til hvide blodlegemer og 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til cellekerner. CTC'erne er identificeret med anti-EpCAM-positive, anti-CD45-negative og DAPI-positive, karakteriseret ved hjælp af et fluorescensmikroskop.

Ud fra vores foreløbige undersøgelser antager efterforskerne derfor, at vores teknologi er nyttig til at isolere cirkulerende tumorceller, og at disse cirkulerende tumorceller sandsynligvis korrelerer med sygdomsaktivitet og ikke findes hos sundhedspersoner.

Overvågningen af ​​cirkulerende tumor-DNA og cirkulerende tumorceller kan give en klinisk værdifuld ledetid til bestemmelse af respons sammenlignet med konventionelle radiologiske metoder.

En kohorte af patienter vil blive rekrutteret til et longitudinelt kohortestudie, hvor væv og blod opsamles til biomarkører. Der er ikke forudset noget indgreb. Undersøgelsen vil blive gennemført over tre år.

Patientprøver og samtykke

Fremadrettet over seks år (august 2014 til august 2020) vil omkring 150 patienter diagnosticeret med lungekræft, som giver fuldt informeret samtykke til denne undersøgelse, få opsamlet tumor og/eller blod og/eller effusioner. Patienter fra andre steder kan blive henvist til disse steder.

Hvis patienter ikke giver samtykke til indsamling af blod til kliniske undersøgelser, men har givet samtykke til og underskrevet informeret operativt samtykke til indsamling af frosset eller formalinfikseret paraffinindlejret materiale til forskningsformål, herunder biopsier, cytologi eller kirurgiske resektioner, som en del af standard kirurgisk samtykkeformular, tumorvæv og normalt væv vil blive indsamlet fra Changi General Hospital. Tumorstadieinddeling og -gradering blev opnået ved gennemgang af patologirapporterne og evaluering af casenotaterne af individuelle klinikere. Skriftligt informeret samtykke til analyse af prospektivt indsamlede kliniske prøver vil blive indhentet fra alle patienter, inklusive samtykke til at få en biopsi-lungevævsprøve til forskningsformål. Der er ikke behov for andre yderligere procedurer end den anbefalede procedure for at fjerne patientens væv til vurdering af tumoren, det være sig bronkoskopi, CT-vejledt biopsi eller åben operation, afhængigt af lægens vurdering. Når rutineproceduren er afsluttet, vil et af vævene blive udvalgt til forskningsformål. "Forskningsvævsblokkene" vil blive anonymiseret og objektglassene sat i batch til efterfølgende undersøgelse/verifikation af tumortilstedeværelse af en patolog.

Hver potentiel patient vil give baseline 3 EDTA-rør med blod (i alt ca. 30 ml). Urin (~100mL) vil blive opsamlet på samme tid til undersøgelse af urin-DNA.

Disse blodprøver vil blive centrifugeret i 10 minutter ved 3000 rpm, til opsamling af serum og plasma til validering af biomarkører identificeret ved mikroarray-analyse, udvælgelse for kandidat-udskilte proteiner i blodet.

Effusioner (pleural eller peritoneal) vil blive opnået som en del af rutinemæssige terapeutiske procedurer som anbefalet af den behandlende kliniker, hvor væskerne ellers ville være blevet kasseret. Der vil på intet tidspunkt blive opnået effusionsvæske til det eneste formål med denne undersøgelse.

Nedstrøms arbejde med hensyn til evaluering af CTC'erne, mononukleære celler fra perifert blod, DNA, RNA, protein og andre genetiske og molekylære materialer vil blive udført. De anvendte teknikker vil omfatte kvantitativ PCR, sekventering, flowcytometri og immunfænotypning, immunhistokemi, fluorescerende in situ-hybridisering, kultur osv.

Mutationsanalyse:

Genetisk materiale vil blive ekstraheret fra 3-5 mL materiale fanget på sigte og fra blodplasma, samt relevant materiale såsom effusioner eller urin. Dette vil blive analyseret ved kvantitativ PCR ved hjælp af specialdesignede primere og/eller sekventering. Genetiske materialer vil også blive profileret ved hjælp af næste generations sekventeringsteknikker til at identificere klinisk handlingsbare mutationer såsom BRAF, ALK, ROS, RET osv.

Prøver vil blive behandlet friske. Enhver resterende prøve vil blive adskilt i buffy coats og plasma og opbevaret i flydende nitrogen og/eller -80C.

Data og prøver afidentificeres til laboratoriebehandling. Hvert websted vil opbevare oplysninger, der forbinder patienten med prøven. Dette er nødvendigt for fastlæggelse af opfølgning.

Identificerede data vil blive placeret på en netværksforbundet pc, fysisk placeret i Changi General Hospital og bag institutionelle firewalls. Individuelt identificerbare data vil blive opbevaret på hospitalet og vil ikke blive delt med laboratoriet.

Dataene vil blive arkiveret til downstream-projekter, når undersøgelsen er afsluttet.