Una valutazione completa del DNA tumorale circolante e delle cellule tumorali circolanti come marcatore predittivo nel cancro del polmone

Il cancro del polmone non è solo tra i primi 3 tipi di cancro più comuni negli uomini e nelle donne, ma è anche la principale causa di mortalità per cancro a Singapore e negli Stati Uniti. La chemioterapia a base di platino è attualmente il cardine del trattamento farmacologico per i malati di cancro ai polmoni, sebbene allevia solo temporaneamente i sintomi correlati alla malattia. Recentemente, l'uso della terapia a bersaglio molecolare ha portato a una migliore sopravvivenza in sottogruppi di pazienti. In particolare, la presenza di mutazioni di EGFR o ALK da biopsie polmonari prevede rispettivamente un miglioramento del tasso di risposta e della sopravvivenza libera da progressione dall'uso di inibitori della tirosin-chinasi o crizotinib. È importante sottolineare che le mutazioni dell'EGFR sono più comuni nei tumori dei pazienti asiatici (circa il 35%) rispetto ai non asiatici (circa il 10%).

La principale causa di mortalità nei pazienti con tumori solidi è rappresentata dalle metastasi da disseminazione attraverso la circolazione sanguigna. La capacità di rilevare la presenza di cellule tumorali in circolo anche prima che si verifichino metastasi conclamate si è evoluta rapidamente negli ultimi anni. È stata trovata l'importanza prognostica del DNA tumorale circolante (ctDNA) e delle cellule tumorali circolanti (CTC) in diversi tumori e questa tecnica è ampiamente riconosciuta per essere di grande importanza clinica e biologica. Questo studio valuta l'uso del ctDNA e delle CTC nella previsione dell'attività della malattia e della risposta ai farmaci nei pazienti con carcinoma polmonare e serve a integrare i metodi esistenti per ottenere un mezzo non invasivo e accurato per guidare le decisioni terapeutiche.

In effetti, l'uso di ctDNA e CTC come marker per la valutazione del rischio e il monitoraggio del trattamento è vantaggioso in quanto è accessibile può essere monitorato regolarmente su base non invasiva. Ciò adatterà meglio i nostri programmi di sorveglianza e il trattamento per ottimizzare i risultati della malattia.

Gli investigatori hanno sviluppato un kit di rilevamento delle mutazioni EGFR che rileva le 3 principali mutazioni EGFR a livelli ultrasensibili. Gli investigatori hanno applicato questo a una varietà di materiali clinici tra cui DNA incorporato in paraffina fissato in formalina, versamenti pleurici, DNA circolante e cellule tumorali circolanti e hanno scoperto che i kit possono rilevare queste mutazioni con elevata sensibilità e specificità.

L'Istituto di bioingegneria e nanotecnologia ha sviluppato un dispositivo filtrante a membrana a microsetaccio per isolare efficacemente le cellule tumorali circolanti dal campione di sangue intero. Il dispositivo sfrutta la differenza di dimensioni tra le cellule tumorali e le cellule del sangue per ottenere la cattura delle cellule tumorali su un filtro a microsetaccio con un tasso di recupero > 85% da 4,5 ml di sangue intero entro 10 minuti, dimostrato con cellule tumorali addizionate a campioni di sangue intero. Il dispositivo contiene una matrice di pori densamente compattati (> 8000 pori/mm^2) con un diametro dei pori ottimizzato di 10 µm. La regolazione dei fluidi e il conteggio delle cellule si ottengono mediante un semplice pompaggio a vuoto e un microscopio a fluorescenza da laboratorio. Le cellule catturate sono colorate con anti-EpCAM-PE per CTC, anti-CD45-FITC per globuli bianchi e 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per nuclei cellulari. Le CTC sono identificate con anti-EpCAM positive, anti-CD45 negative e DAPI positive, caratterizzate mediante microscopio a fluorescenza.

Quindi, dai nostri studi preliminari, i ricercatori ipotizzano che la nostra tecnologia sia utile per isolare le cellule tumorali circolanti e che queste cellule tumorali circolanti siano probabilmente correlate con l'attività della malattia e non si trovino negli individui sani.

Il monitoraggio del DNA tumorale circolante e delle cellule tumorali circolanti può fornire un lead time clinicamente prezioso per determinare la risposta, rispetto ai metodi radiologici convenzionali.

Verrà reclutata una coorte di pazienti per uno studio di coorte longitudinale in cui vengono raccolti tessuti e sangue per i biomarcatori. Non è previsto alcun intervento. Lo studio sarà condotto nell'arco di tre anni.

Campioni e consenso dei pazienti

Prospetticamente nell'arco di sei anni (da agosto 2014 ad agosto 2020), a circa 150 pazienti con diagnosi di cancro del polmone che forniscono il pieno consenso informato a questo studio verranno raccolti tumori e/o sangue e/o versamenti. I pazienti provenienti da altre località possono essere indirizzati a questi siti.

Se i pazienti non acconsentono alla raccolta di sangue per studi clinici ma hanno acconsentito e firmato il consenso operativo informato per la raccolta di materiale paraffinato congelato o fissato in formalina per scopi di ricerca, comprese biopsie, citologia o resezioni chirurgiche come parte del modulo di consenso chirurgico standard, il tessuto tumorale e il tessuto normale saranno prelevati dal Changi General Hospital. La stadiazione e la classificazione del tumore sono state ottenute dalla revisione dei rapporti patologici e dalla valutazione delle note del caso da parte dei singoli investigatori clinici. Il consenso informato scritto per l'analisi di campioni clinici raccolti in modo prospettico sarà ottenuto da tutti i pazienti, compreso il consenso per ottenere un campione di tessuto polmonare bioptico a scopo di ricerca. Non sono necessarie altre procedure aggiuntive oltre alla procedura raccomandata per rimuovere il tessuto del paziente per la valutazione del tumore, che si tratti di broncoscopia, biopsia guidata da TC o chirurgia a cielo aperto, a seconda della valutazione del medico. Una volta completata la procedura di routine, uno dei tessuti verrà selezionato per scopi di ricerca. I "blocchi di tessuto di ricerca" saranno resi anonimi e i vetrini raggruppati per il successivo esame/verifica della presenza del tumore da parte di un patologo.

Ogni potenziale paziente fornirà al basale 3 provette di sangue EDTA (per un totale di circa 30 ml). L'urina (~100 ml) sarà raccolta contemporaneamente per lo studio del DNA urinario.

Questi campioni di sangue saranno centrifugati per 10 minuti a 3000 rpm, per la raccolta di siero e plasma per la validazione dei biomarcatori identificati mediante analisi di microarray, selezionando le proteine ​​candidate secrete nel sangue.

I versamenti (pleurici o peritoneali) saranno ottenuti come parte delle procedure terapeutiche di routine come raccomandato dal medico curante, dove i fluidi sarebbero stati altrimenti eliminati. In nessun momento sarà ottenuto fluido di versamento per il solo scopo di questo studio.

Verrà eseguito un lavoro a valle in termini di valutazione delle CTC, delle cellule mononucleate del sangue periferico, del DNA, dell'RNA, delle proteine ​​e di altri materiali genetici e molecolari. Le tecniche applicate includeranno PCR quantitativa, sequenziamento, citometria a flusso e immunofenotipizzazione, immunoistochimica, ibridazione fluorescente in situ, coltura, ecc.

Analisi mutazionale:

Il materiale genetico sarà estratto da 3-5 mL di materiale intrappolato su setaccio e dal plasma sanguigno, così come materiale rilevante come versamenti o urine. Questo sarà analizzato mediante PCR quantitativa utilizzando primer progettati su misura e/o sequenziamento. I materiali genetici saranno anche profilati utilizzando tecniche di sequenziamento di nuova generazione per identificare mutazioni clinicamente attuabili come BRAF, ALK, ROS, RET, ecc.

I campioni saranno processati freschi. Qualsiasi campione rimanente sarà separato in buffy coat e plasma e conservato in azoto liquido e/o -80°C.

I dati e i campioni vengono resi anonimi per l'elaborazione in laboratorio. Ogni sito conserverà le informazioni che collegano il paziente al campione. Ciò è necessario per la determinazione del follow-up.

I dati identificati si troveranno su un PC in rete, situato fisicamente nel Changi General Hospital e dietro i firewall istituzionali. I dati identificabili individualmente saranno conservati in ospedale e non saranno condivisi con il laboratorio.

I dati saranno archiviati per i progetti a valle una volta completato lo studio.