Всесторонняя оценка циркулирующей опухолевой ДНК и циркулирующих опухолевых клеток в качестве прогностического маркера рака легкого

Рак легких не только входит в тройку наиболее распространенных видов рака как у мужчин, так и у женщин, но также является основной причиной смертности от рака в Сингапуре и США. Химиотерапия на основе платины в настоящее время является основой медикаментозного лечения больных раком легких, хотя она лишь временно облегчает симптомы, связанные с заболеванием. В последнее время использование молекулярно-таргетной терапии привело к улучшению выживаемости в подгруппах пациентов. В частности, наличие мутаций EGFR или ALK в биоптатах легкого предсказывает улучшение частоты ответа и выживаемости без прогрессирования при использовании ингибиторов тирозинкиназы или кризотиниба соответственно. Важно отметить, что мутации EGFR чаще встречаются в опухолях у азиатских пациентов (около 35%) по сравнению с неазиатами (около 10%).

Основной причиной смертности у пациентов с солидными опухолями являются метастазы от диссеминации через кровообращение. Способность обнаруживать наличие опухолевых клеток в циркуляции даже до появления явных метастазов быстро развивалась в последние годы. Было обнаружено прогностическое значение циркулирующей опухолевой ДНК (цтДНК) и циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) при некоторых видах рака, и широко признано, что этот метод имеет большое клиническое и биологическое значение. В этом исследовании оценивается использование цтДНК и ЦОК для прогнозирования активности заболевания и ответа на лекарства у пациентов с раком легких, и оно служит дополнением к существующим методам для получения неинвазивных и точных средств для принятия решений о лечении.

Действительно, использование цтДНК и ЦОК в качестве маркеров для оценки риска и мониторинга лечения является выгодным, поскольку оно доступно для регулярного неинвазивного мониторинга. Это позволит лучше адаптировать наши программы эпиднадзора и лечения для оптимизации исходов заболевания.

Исследователи разработали набор для обнаружения мутаций EGFR, который выявляет 3 основные мутации EGFR на сверхчувствительных уровнях. Исследователи применили это к различным клиническим материалам, включая фиксированную формалином залитую в парафин ДНК, плевральный выпот, циркулирующую ДНК, а также циркулирующие опухолевые клетки, и обнаружили, что наборы могут улавливать эти мутации с высокой чувствительностью и специфичностью.

В Институте биоинженерии и нанотехнологий разработано микросито-мембранное фильтрующее устройство для эффективного выделения циркулирующих опухолевых клеток из образца цельной крови. Устройство использует разницу в размерах между раковыми клетками и клетками крови для захвата раковых клеток на микроситовом фильтре с коэффициентом извлечения > 85% из 4,5 мл цельной крови в течение 10 минут, что продемонстрировано при добавлении раковых клеток в образцы цельной крови. Устройство содержит плотно упакованный массив пор (> 8000 пор/мм^2) с оптимизированным диаметром пор 10 мкм. Регулирование жидкости и подсчет клеток осуществляются с помощью простой вакуумной откачки и лабораторного флуоресцентного микроскопа. Захваченные клетки окрашивают анти-EpCAM-PE для ЦОК, анти-CD45-FITC для лейкоцитов и 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для клеточных ядер. ЦОК идентифицируют как анти-EpCAM-положительные, анти-CD45-отрицательные и DAPI-положительные, охарактеризованные с использованием флуоресцентного микроскопа.

Следовательно, на основании наших предварительных исследований исследователи предполагают, что наша технология полезна для выделения циркулирующих опухолевых клеток и что эти циркулирующие опухолевые клетки, вероятно, коррелируют с активностью заболевания и не обнаруживаются у здоровых людей.

Мониторинг циркулирующей опухолевой ДНК и циркулирующих опухолевых клеток может обеспечить клинически ценное время для определения ответа по сравнению с обычными рентгенологическими методами.

Когорта пациентов будет набрана для продольного когортного исследования, в ходе которого ткани и кровь будут собираться для определения биомаркеров. Никакого вмешательства не предвидится. Исследование будет проводиться в течение трех лет.

Образцы пациентов и согласие

Проспективно в течение шести лет (с августа 2014 г. по август 2020 г.) примерно у 150 пациентов с диагнозом рак легких, давших полное информированное согласие на участие в этом исследовании, будут взяты опухоль и/или кровь и/или выпот. В эти центры могут быть направлены пациенты из других мест.

Если пациенты не дают согласия на забор крови для клинических исследований, но дали согласие и подписали информированное оперативное согласие на сбор замороженного или фиксированного формалином залитого в парафин материала для исследовательских целей, включая биопсию, цитологию или хирургические резекции, как часть стандартной формы согласия на хирургическое вмешательство, опухолевая ткань и нормальная ткань будут взяты из больницы общего профиля Чанги. Стадия и классификация опухоли были получены на основе анализа отчетов о патологии и оценки историй болезни отдельными клиницистами-исследователями. От всех пациентов будет получено письменное информированное согласие на анализ проспективно собранных клинических образцов, включая согласие на получение биоптата легочной ткани для исследовательских целей. Никаких других дополнительных процедур не требуется, кроме рекомендуемой процедуры удаления ткани пациента для оценки опухоли, будь то бронхоскопия, биопсия под контролем КТ или открытая операция, в зависимости от оценки врача. После завершения обычной процедуры одна из тканей будет выбрана для исследовательских целей. «Исследуемые блоки тканей» будут анонимизированы, а слайды объединены в пакеты для последующего изучения/подтверждения наличия опухоли патологоанатомом.

Каждому предполагаемому пациенту будут предоставлены исходные 3 пробирки крови с ЭДТА (всего около 30 мл). Одновременно будет собираться моча (~100 мл) для исследования ДНК мочи.

Эти образцы крови будут центрифугированы в течение 10 минут при 3000 об/мин для сбора сыворотки и плазмы для проверки биомаркеров, идентифицированных с помощью микрочипового анализа, отбора секретируемых белков-кандидатов в крови.

Выпот (плевральный или перитонеальный) будет получен как часть рутинных терапевтических процедур в соответствии с рекомендациями лечащего врача, в противном случае жидкости были бы удалены. Ни в коем случае не будет получена выпотная жидкость для единственной цели этого исследования.

Далее будет проведена работа по оценке ЦОК, мононуклеарных клеток периферической крови, ДНК, РНК, белков и других генетических и молекулярных материалов. Применяемые методы будут включать количественную ПЦР, секвенирование, проточную цитометрию и иммунофенотипирование, иммуногистохимию, флуоресцентную гибридизацию in situ, культуру и т. д.

Мутационный анализ:

Генетический материал будет извлечен из 3-5 мл материалов, попавших на сито, и из плазмы крови, а также из соответствующего материала, такого как выпот или моча. Это будет проанализировано с помощью количественной ПЦР с использованием специально разработанных праймеров и/или секвенирования. Генетические материалы также будут профилированы с использованием методов секвенирования следующего поколения для выявления клинически действенных мутаций, таких как BRAF, ALK, ROS, RET и т. д.

Образцы будут обрабатываться свежими. Любой оставшийся образец будет разделен на лейкоцитарную пленку и плазму и храниться в жидком азоте и/или при температуре -80°C.

Данные и образцы деидентифицированы для лабораторной обработки. На каждом сайте будет храниться информация, связывающая пациента с образцом. Это необходимо для определения последующего наблюдения.

Идентифицированные данные будут храниться на сетевом ПК, физически расположенном в больнице общего профиля Чанги и за брандмауэрами учреждения. Индивидуально идентифицируемые данные будут храниться в больнице и не будут передаваться в лабораторию.

Данные будут заархивированы для последующих проектов после завершения исследования.