A keringő tumor-DNS és a keringő daganatsejtek átfogó értékelése mint előrejelző marker a tüdőrákban

A tüdőrák nemcsak a 3 leggyakoribb ráktípus közé tartozik mind a férfiak, mind a nők körében, hanem a rákos halálozás vezető oka is Szingapúrban és az Egyesült Államokban. A platinaalapú kemoterápia jelenleg a tüdőrákos betegek gyógyszeres kezelésének alappillére, bár csak átmenetileg enyhíti a betegséggel összefüggő tüneteket. A közelmúltban a molekulárisan célzott terápia alkalmazása a betegek alcsoportjaiban a túlélés javulását eredményezte. A tüdőbiopsziákból származó EGFR- vagy ALK-mutációk jelenléte a tirozin-kináz-inhibitorok, illetve a krizotinib alkalmazásából adódó jobb válaszarányt és progressziómentes túlélést jelez előre. Fontos, hogy az EGFR-mutációk gyakrabban fordulnak elő ázsiai betegek daganataiban (körülbelül 35%), mint nem ázsiai betegekben (körülbelül 10%).

A szolid rákos betegek halálozásának fő oka a vérkeringés útján terjedő metasztázisok. Az elmúlt években gyorsan fejlődött az a képesség, hogy kimutatható legyen a keringésben lévő daganatsejtek jelenléte még a nyilvánvaló áttétek megjelenése előtt. A keringő tumor-DNS (ctDNS) és keringő tumorsejtek (CTC-k) prognosztikai jelentőségét számos rák esetében kimutatták, és széles körben elismerték, hogy ez a technika jelentős klinikai és biológiai jelentőséggel bír. Ez a tanulmány a ctDNS és a CTC-k használatát értékeli a tüdőrákos betegek betegségaktivitásának és gyógyszerválaszának előrejelzésében, és kiegészíti a meglévő módszereket a kezelési döntések nem invazív és pontos útmutatása érdekében.

Valójában a ctDNS és a CTC-k használata markerként a kockázatértékeléshez és a kezelés monitorozásához előnyös, mivel hozzáférhető, nem invazív alapon rendszeresen ellenőrizhető. Ez jobban személyre szabja felügyeleti programjainkat és kezeléseinket a betegség kimenetelének optimalizálása érdekében.

A nyomozók kifejlesztettek egy EGFR-mutáció-detektáló készletet, amely ultraérzékeny szinten detektálja a 3 fő EGFR-mutációt. A kutatók ezt számos klinikai anyagra alkalmazták, beleértve a formalinnal rögzített paraffinba ágyazott DNS-t, a pleurális folyadékot, a keringő DNS-t, valamint a keringő tumorsejteket, és megállapították, hogy a kitek nagy érzékenységgel és specifitással képesek felvenni ezeket a mutációkat.

A Biomérnöki és Nanotechnológiai Intézet kifejlesztett egy mikroszita membránszűrő eszközt, amely hatékonyan izolálja a keringő daganatsejteket teljes vérmintából. Az eszköz a rákos sejtek és a vérsejtek közötti méretkülönbséget kihasználva éri el a rákos sejtek befogását egy mikroszita szűrőn, 4,5 ml teljes vérből 10 percen belül > 85%-os visszanyerési arány mellett, amelyet teljes vérmintákba helyezett rákos sejtekkel mutattak ki. Az eszköz egy sűrűn tömörített pórustömböt (> 8000 pórus/mm^2) tartalmaz, 10 µm optimalizált pórusátmérővel. A folyadékszabályozás és a sejtszámlálás egyszerű vákuumszivattyús és laboratóriumi fluoreszcens mikroszkóp segítségével történik. A befogott sejteket CTC-k esetében anti-EpCAM-PE-vel, fehérvérsejtek esetében anti-CD45-FITC-vel, sejtmagok esetében 4',6-diamidino-2-fenil-indollal (DAPI) festjük. A CTC-ket anti-EpCAM-pozitív, anti-CD45-negatív és DAPI-pozitív tulajdonságokkal azonosítják, amelyeket fluoreszcens mikroszkóppal jellemeznek.

Ezért előzetes tanulmányaink alapján a kutatók azt feltételezik, hogy technológiánk hasznos a keringő daganatsejtek izolálására, és ezek a keringő daganatsejtek valószínűleg korrelálnak a betegség aktivitásával, és nem találhatók meg egészséges egyénekben.

A keringő tumor DNS és a keringő tumorsejtek monitorozása klinikailag értékes átfutási időt biztosíthat a válasz meghatározásához a hagyományos radiológiai módszerekkel összehasonlítva.

A betegek egy csoportját toborozzák egy longitudinális kohorszvizsgálathoz, ahol szövetet és vért gyűjtenek a biomarkerek meghatározásához. Nem terveznek beavatkozást. A tanulmány három éven keresztül zajlik majd.

Betegminták és beleegyezés

Hat éven át (2014. augusztustól 2020. augusztusig) körülbelül 150 tüdőrákkal diagnosztizált betegtől, akik teljes körű tájékoztatáson alapuló beleegyezését adják e vizsgálatba, daganatot és/vagy vért és/vagy effúziót gyűjtenek. Más helyekről érkező betegek is ezekre az oldalakra irányíthatók.

Ha a betegek nem járulnak hozzá a klinikai vizsgálatok céljára történő vérvételhez, de beleegyeztek és aláírták a fagyasztott vagy formalinnal fixált paraffinba ágyazott anyag kutatási célú gyűjtését, beleértve a biopsziát, a citológiát vagy a sebészeti reszekciót a szabványos műtéti beleegyezési űrlap részeként, daganatszövetet és normál szövetet a Changi Általános Kórházból gyűjtenek be. A tumor stádiumát és osztályozását a patológiai jelentések áttekintése és az eseti feljegyzések egyéni klinikusok általi értékelése alapján határozták meg. Minden betegtől írásos beleegyezést kell kérni a tervezetten gyűjtött klinikai minták elemzéséhez, beleértve a biopsziás tüdőszövetminta kutatási célú vételéhez való hozzájárulást is. Nincs szükség más további eljárásokra, mint az ajánlott eljárás a páciens szövetének eltávolítására a daganat felméréséhez, legyen az bronchoszkópia, CT-vezérelt biopszia vagy nyitott műtét, az orvos értékelésétől függően. A rutin eljárás befejezése után az egyik szövetet kiválasztják kutatási célokra. A „kutatási szövetblokkokat” anonimizálják, és a tárgylemezeket kötegekkel látják el a tumor jelenlétének egy patológus általi későbbi vizsgálatához/ellenőrzéséhez.

Minden leendő páciensnek 3 EDTA-csöves vért kell biztosítania (összesen körülbelül 30 ml). Vizeletet (~100 ml) ugyanabban az időben gyűjtenek a vizelet DNS vizsgálatához.

Ezeket a vérmintákat 10 percig 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugálják a szérum és plazma összegyűjtése céljából a microarray analízissel azonosított biomarkerek validálásához, kiválasztva a vérben lévő jelölt fehérjéket.

A (pleurális vagy peritoneális) folyadékgyülem a kezelőorvos által javasolt rutin terápiás eljárások részeként történik, ahol a folyadékot egyébként eldobták volna. Soha nem nyerünk effúziós folyadékot e vizsgálat kizárólagos céljára.

A CTC-k, a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek, a DNS-nek, az RNS-nek, a fehérjéknek és más genetikai és molekuláris anyagoknak a kiértékelésével kapcsolatos downstream munkát végeznek. Az alkalmazott technikák közé tartozik a kvantitatív PCR, a szekvenálás, az áramlási citometria és az immunfenotipizálás, az immunhisztokémia, a fluoreszcens in situ hibridizáció, a tenyésztés stb.

Mutációs elemzés:

A genetikai anyagot 3-5 ml szitán rekedt anyagból és vérplazmából, valamint olyan releváns anyagokból vonják ki, mint az effúzió vagy a vizelet. Ezt kvantitatív PCR-rel elemezzük, egyedi tervezésű primerek és/vagy szekvenálás segítségével. A genetikai anyagokat a következő generációs szekvenálási technikákkal is profilozni fogják, hogy azonosítsák a klinikailag hatásos mutációkat, mint például a BRAF, ALK, ROS, RET stb.

A mintákat frissen dolgozzák fel. A megmaradt mintát buffy coat-ra és plazmára választják, és folyékony nitrogénben és/vagy -80 °C-on tárolják.

Az adatok és a minták azonosítása megszűnik a laboratóriumi feldolgozás céljából. Minden oldal megőrzi a pácienst a mintával összekötő információkat. Ez szükséges a nyomon követés meghatározásához.

Az azonosított adatok egy hálózatba kapcsolt számítógépen lesznek elhelyezve, fizikailag a Changi Általános Kórházban és az intézményi tűzfalak mögött. Az egyénileg azonosítható adatokat a kórház megőrzi, és nem osztja meg a laboratóriummal.

Az adatok archiválásra kerülnek a későbbi projektekhez, amint a tanulmány elkészül.