Eine umfassende Bewertung der zirkulierenden Tumor-DNA und der zirkulierenden Tumorzellen als prädiktiver Marker bei Lungenkrebs

Lungenkrebs gehört nicht nur zu den drei häufigsten Krebsarten bei Männern und Frauen, sondern ist auch die häufigste Krebstodesursache in Singapur und den Vereinigten Staaten. Die platinbasierte Chemotherapie ist derzeit die wichtigste medikamentöse Behandlung von Lungenkrebspatienten, obwohl sie die krankheitsbedingten Symptome nur vorübergehend lindert. In jüngster Zeit hat der Einsatz einer molekular zielgerichteten Therapie zu einer Verbesserung des Überlebens bei Untergruppen von Patienten geführt. Insbesondere das Vorhandensein von EGFR- oder ALK-Mutationen aus Lungenbiopsien sagt eine verbesserte Ansprechrate und ein progressionsfreies Überleben durch die Verwendung von Tyrosinkinase-Inhibitoren bzw. Crizotinib voraus. Wichtig ist, dass EGFR-Mutationen häufiger bei Tumoren asiatischer Patienten (ca. 35 %) als bei Nicht-Asiaten (ca. 10 %) vorkommen.

Die Haupttodesursache bei Patienten mit soliden Krebserkrankungen sind Metastasen, die durch die Verbreitung über den Blutkreislauf entstehen. Die Fähigkeit, das Vorhandensein von Tumorzellen im Blutkreislauf zu erkennen, noch bevor offene Metastasen auftreten, hat sich in den letzten Jahren rasant weiterentwickelt. Die prognostische Bedeutung zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA) und zirkulierender Tumorzellen (CTCs) bei mehreren Krebsarten wurde festgestellt, und es wird allgemein anerkannt, dass diese Technik von großer klinischer und biologischer Bedeutung ist. Diese Studie bewertet den Einsatz von ctDNA und CTCs bei der Vorhersage der Krankheitsaktivität und der Arzneimittelreaktion bei Lungenkrebspatienten und dient der Ergänzung bestehender Methoden, um eine nicht-invasive und genaue Methode zur Steuerung von Behandlungsentscheidungen zu erhalten.

Tatsächlich ist die Verwendung von ctDNA und CTCs als Marker für die Risikobewertung und Behandlungsüberwachung von Vorteil, da sie zugänglich sind und regelmäßig und nicht-invasiv überwacht werden können. Dadurch werden unsere Überwachungsprogramme und Behandlungen besser auf die Optimierung der Krankheitsergebnisse zugeschnitten.

Die Forscher haben ein EGFR-Mutationserkennungskit entwickelt, das die drei wichtigsten EGFR-Mutationen auf ultraempfindlichen Ebenen erkennt. Die Forscher haben dies auf eine Vielzahl klinischer Materialien angewendet, darunter formalinfixierte, in Paraffin eingebettete DNA, Pleuraergüsse, zirkulierende DNA sowie zirkulierende Tumorzellen, und haben festgestellt, dass die Kits diese Mutationen mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität erkennen können.

Das Institut für Bioingenieurwesen und Nanotechnologie hat ein Mikrosiebmembranfiltergerät zur wirksamen Isolierung zirkulierender Tumorzellen aus Vollblutproben entwickelt. Das Gerät nutzt den Größenunterschied zwischen Krebszellen und Blutzellen, um die Krebszellen auf einem Mikrosiebfilter mit einer Rückgewinnungsrate von > 85 % aus 4,5 ml Vollblut innerhalb von 10 Minuten einzufangen, was anhand von Krebszellen nachgewiesen wurde, die Vollblutproben beigemischt wurden. Das Gerät enthält ein dicht gepacktes Porenarray (> 8000 Poren/mm^2) mit einem optimierten Porendurchmesser von 10 µm. Die Flüssigkeitsregulierung und die Zellzählung werden durch eine einfache Vakuumpumpe und ein Laborfluoreszenzmikroskop erreicht. Die eingefangenen Zellen werden mit Anti-EpCAM-PE für CTCs, Anti-CD45-FITC für weiße Blutkörperchen und 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für Zellkerne gefärbt. Die CTCs werden als Anti-EpCAM-positiv, Anti-CD45-negativ und DAPI-positiv identifiziert und unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops charakterisiert.

Aufgrund unserer vorläufigen Studien gehen die Forscher daher davon aus, dass unsere Technologie zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen nützlich ist und dass diese zirkulierenden Tumorzellen wahrscheinlich mit der Krankheitsaktivität korrelieren und bei gesunden Personen nicht vorkommen.

Die Überwachung der zirkulierenden Tumor-DNA und der zirkulierenden Tumorzellen kann im Vergleich zu herkömmlichen radiologischen Methoden eine klinisch wertvolle Vorlaufzeit bei der Bestimmung des Ansprechens bieten.

Eine Kohorte von Patienten wird für eine Längsschnitt-Kohortenstudie rekrutiert, bei der Gewebe und Blut für Biomarker gesammelt werden. Ein Eingriff ist nicht vorgesehen. Die Studie wird über einen Zeitraum von drei Jahren durchgeführt.

Patientenproben und Einwilligung

Voraussichtlich über einen Zeitraum von sechs Jahren (August 2014 bis August 2020) werden bei etwa 150 Patienten, bei denen Lungenkrebs diagnostiziert wurde und die vollständig nach Aufklärung in diese Studie einwilligen, Tumore und/oder Blut und/oder Ergüsse gesammelt. Patienten von anderen Standorten können an diese Standorte verwiesen werden.

Wenn Patienten der Blutentnahme für klinische Studien nicht zustimmen, aber im Rahmen der standardmäßigen chirurgischen Einverständniserklärung der Entnahme von gefrorenem oder formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Material zu Forschungszwecken, einschließlich Biopsien, Zytologie oder chirurgischen Resektionen, zugestimmt und eine Einverständniserklärung unterzeichnet haben, Tumorgewebe und normales Gewebe werden vom Changi General Hospital entnommen. Das Stadieneinteilung und die Einstufung des Tumors wurden anhand der Durchsicht der Pathologieberichte und der Auswertung der Fallnotizen durch einzelne klinische Untersucher ermittelt. Von allen Patienten wird eine schriftliche Einverständniserklärung zur Analyse voraussichtlich entnommener klinischer Proben eingeholt, einschließlich der Einwilligung zur Entnahme einer Biopsie-Lungengewebeprobe zu Forschungszwecken. Außer dem empfohlenen Verfahren zur Gewebeentnahme des Patienten zur Beurteilung des Tumors sind keine weiteren zusätzlichen Verfahren erforderlich, sei es Bronchoskopie, CT-gesteuerte Biopsie oder offene Operation, je nach Einschätzung des Arztes. Sobald das Routineverfahren abgeschlossen ist, wird eines der Gewebe für Forschungszwecke ausgewählt. Die „Forschungsgewebeblöcke“ werden anonymisiert und die Objektträger zur anschließenden Untersuchung/Verifizierung des Tumorvorliegens durch einen Pathologen gestapelt.

Jeder potenzielle Patient erhält zu Beginn 3 EDTA-Röhrchen Blut (insgesamt ca. 30 ml). Gleichzeitig wird Urin (~100 ml) zur Untersuchung der Urin-DNA gesammelt.

Diese Blutproben werden 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert, um Serum und Plasma zur Validierung von Biomarkern zu sammeln, die durch Microarray-Analyse identifiziert wurden, und um mögliche sekretierte Proteine ​​im Blut auszuwählen.

Ergüsse (Pleura- oder Peritonealerguss) werden im Rahmen routinemäßiger therapeutischer Verfahren gemäß den Empfehlungen des behandelnden Arztes entnommen, wo die Flüssigkeiten andernfalls entsorgt worden wären. Zu keinem Zeitpunkt wird Ergussflüssigkeit ausschließlich für den Zweck dieser Studie entnommen.

Nachgelagerte Arbeiten im Hinblick auf die Bewertung der CTCs, mononukleären Zellen des peripheren Blutes, DNA, RNA, Protein und anderer genetischer und molekularer Materialien werden durchgeführt. Zu den angewandten Techniken gehören quantitative PCR, Sequenzierung, Durchflusszytometrie und Immunphänotypisierung, Immunhistochemie, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, Kultur usw.

Mutationsanalyse:

Genetisches Material wird aus 3–5 ml auf dem Sieb aufgefangenem Material und aus Blutplasma sowie relevantem Material wie Ergüssen oder Urin extrahiert. Dies wird durch quantitative PCR unter Verwendung speziell entwickelter Primer und/oder Sequenzierung analysiert. Genetische Materialien werden auch mithilfe von Sequenzierungstechniken der nächsten Generation profiliert, um klinisch verwertbare Mutationen wie BRAF, ALK, ROS, RET usw. zu identifizieren.

Die Proben werden frisch verarbeitet. Die verbleibende Probe wird in Buffy Coats und Plasma getrennt und in flüssigem Stickstoff und/oder bei -80 °C gelagert.

Daten und Proben werden für die Laborverarbeitung anonymisiert. Jeder Standort speichert Informationen, die den Patienten mit der Probe verknüpfen. Dies ist für die Festlegung der Folgemaßnahmen erforderlich.

Die identifizierten Daten werden auf einem vernetzten PC gespeichert, der sich physisch im Changi General Hospital und hinter institutionellen Firewalls befindet. Individuell identifizierbare Daten werden im Krankenhaus gespeichert und nicht an das Labor weitergegeben.

Nach Abschluss der Studie werden die Daten für nachgelagerte Projekte archiviert.