Une évaluation complète de l'ADN tumoral circulant et des cellules tumorales circulantes en tant que marqueur prédictif du cancer du poumon

Le cancer du poumon est non seulement parmi les 3 types de cancer les plus courants chez les hommes et les femmes, mais aussi la principale cause de mortalité par cancer à Singapour et aux États-Unis. La chimiothérapie à base de platine est actuellement le pilier du traitement médicamenteux des patients atteints de cancer du poumon, bien qu'elle ne soulage que temporairement les symptômes liés à la maladie. Récemment, l'utilisation d'une thérapie moléculaire ciblée a permis d'améliorer la survie de sous-groupes de patients. En particulier, la présence de mutations EGFR ou ALK à partir de biopsies pulmonaires prédit un taux de réponse amélioré et une survie sans progression grâce à l'utilisation d'inhibiteurs de tyrosine kinase ou de crizotinib respectivement. Il est important de noter que les mutations de l'EGFR sont plus fréquentes dans les tumeurs des patients asiatiques (environ 35 %) que chez les non-Asiatiques (environ 10 %).

La principale cause de mortalité chez les patients atteints de cancers solides est les métastases de dissémination via la circulation sanguine. La capacité à détecter la présence de cellules tumorales en circulation avant même l'apparition de métastases manifestes a évolué rapidement ces dernières années. L'importance pronostique de l'ADN tumoral circulant (ctDNA) et des cellules tumorales circulantes (CTC) dans plusieurs cancers a été démontrée et cette technique est largement reconnue comme étant d'une importance clinique et biologique majeure. Cette étude évalue l'utilisation de l'ADNct et des CTC pour prédire l'activité de la maladie et la réponse aux médicaments chez les patients atteints de cancer du poumon et sert à compléter les méthodes existantes pour obtenir un moyen non invasif et précis d'orienter les décisions de traitement.

En effet, l'utilisation de l'ADNct et des CTC comme marqueur pour l'évaluation des risques et le suivi du traitement est avantageuse car il est accessible et peut être suivi régulièrement de manière non invasive. Cela permettra de mieux adapter nos programmes de surveillance et nos traitements pour optimiser les résultats de la maladie.

Les enquêteurs ont développé un kit de détection de mutation EGFR qui détecte les 3 principales mutations EGFR à des niveaux ultrasensibles. Les enquêteurs ont appliqué cela à une variété de matériaux cliniques, y compris l'ADN inclus dans la paraffine fixée au formol, les épanchements pleuraux, l'ADN circulant ainsi que les cellules tumorales circulantes et ont découvert que les kits peuvent capter ces mutations avec une sensibilité et une spécificité élevées.

Un dispositif de filtre à membrane à micro-tamis pour isoler efficacement les cellules tumorales en circulation d'un échantillon de sang total a été développé par l'Institut de bioingénierie et de nanotechnologie. L'appareil exploite la différence de taille entre les cellules cancéreuses et les cellules sanguines pour obtenir la capture des cellules cancéreuses sur un filtre à microtamis avec un taux de récupération > 85 % à partir de 4,5 ml de sang total en 10 min, démontré avec des cellules cancéreuses ajoutées à des échantillons de sang total. L'appareil contient un réseau de pores denses (> 8000 pores/mm^2) avec un diamètre de pores optimisé de 10 µm. La régulation des fluides et le comptage des cellules sont réalisés par un simple pompage sous vide et un microscope à fluorescence de laboratoire. Les cellules capturées sont colorées avec anti-EpCAM-PE pour les CTC, anti-CD45-FITC pour les globules blancs et 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour les noyaux cellulaires. Les CTC sont identifiés anti-EpCAM positifs, anti-CD45 négatifs et DAPI positifs, caractérisés à l'aide d'un microscope à fluorescence.

Par conséquent, à partir de nos études préliminaires, les chercheurs émettent l'hypothèse que notre technologie est utile pour isoler les cellules tumorales circulantes et que ces cellules tumorales circulantes sont probablement corrélées à l'activité de la maladie et ne se trouvent pas chez les individus en bonne santé.

La surveillance de l'ADN tumoral circulant et des cellules tumorales circulantes peut fournir un délai cliniquement précieux pour déterminer la réponse, par rapport aux méthodes radiologiques conventionnelles.

Une cohorte de patients sera recrutée pour une étude de cohorte longitudinale où des tissus et du sang sont prélevés pour les biomarqueurs. Aucune intervention n'est envisagée. L'étude se déroulera sur trois ans.

Échantillons des patients et consentement

Prospectivement sur six ans (d'août 2014 à août 2020), environ 150 patients diagnostiqués avec un cancer du poumon qui fournissent un consentement éclairé complet à cette étude auront une tumeur et/ou du sang et/ou des épanchements prélevés. Les patients d'autres endroits peuvent être référés à ces sites.

Si les patients ne consentent pas au prélèvement de sang pour des études cliniques mais ont consenti et signé un consentement opératoire éclairé pour le prélèvement de matériel congelé ou fixé au formol enrobé de paraffine à des fins de recherche, y compris les biopsies, la cytologie ou les résections chirurgicales dans le cadre du formulaire de consentement chirurgical standard, les tissus tumoraux et les tissus normaux seront prélevés à l'hôpital général de Changi. La stadification et le classement des tumeurs ont été obtenus à partir de l'examen des rapports de pathologie et de l'évaluation des notes de cas par des chercheurs cliniciens individuels. Un consentement éclairé écrit pour l'analyse d'échantillons cliniques prélevés de manière prospective sera obtenu de tous les patients, y compris le consentement pour obtenir un échantillon de tissu pulmonaire par biopsie à des fins de recherche. Aucune autre procédure supplémentaire n'est nécessaire autre que la procédure recommandée pour retirer les tissus du patient pour l'évaluation de la tumeur, qu'il s'agisse d'une bronchoscopie, d'une biopsie guidée par tomodensitométrie ou d'une chirurgie ouverte, selon l'évaluation du médecin. Une fois la procédure de routine terminée, l'un des tissus sera sélectionné à des fins de recherche. Les "blocs de tissus de recherche" seront anonymisés et les lames regroupées pour un examen/vérification ultérieur de la présence de tumeurs par un pathologiste.

Chaque patient potentiel fournira 3 tubes de sang EDTA de base (total d'environ 30 ml). L'urine (~100mL) sera collectée en même temps pour l'étude de l'ADN urinaire.

Ces échantillons de sang seront centrifugés pendant 10 minutes à 3000 rpm, pour la collecte de sérum et de plasma pour la validation de biomarqueurs identifiés par analyse de puces à ADN, sélectionnant des protéines candidates sécrétées dans le sang.

Les épanchements (pleuraux ou péritonéaux) seront obtenus dans le cadre des procédures thérapeutiques de routine recommandées par le clinicien traitant, où les fluides auraient autrement été jetés. À aucun moment, le liquide d'épanchement ne sera obtenu dans le seul but de cette étude.

Des travaux en aval en termes d'évaluation des CTC, des cellules mononucléaires du sang périphérique, de l'ADN, de l'ARN, des protéines et d'autres matériels génétiques et moléculaires seront effectués. Les techniques appliquées comprendront la PCR quantitative, le séquençage, la cytométrie en flux et l'immunophénotypage, l'immunohistochimie, l'hybridation fluorescente in situ, la culture, etc.

Analyse mutationnelle :

Le matériel génétique sera extrait de 3 à 5 ml de matériel piégé sur un tamis et de plasma sanguin, ainsi que de matériel pertinent tel que des épanchements ou de l'urine. Celle-ci sera analysée par PCR quantitative à l'aide d'amorces conçues sur mesure et/ou de séquençage. Le matériel génétique sera également profilé à l'aide de techniques de séquençage de nouvelle génération pour identifier les mutations cliniquement exploitables telles que BRAF, ALK, ROS, RET, etc.

Les échantillons seront traités frais. Tout échantillon restant sera séparé en couches leucocytaires et plasma et stocké dans de l'azote liquide et/ou à -80°C.

Les données et les échantillons sont anonymisés pour le traitement en laboratoire. Chaque site conservera les informations reliant le patient à l'échantillon. Ceci est nécessaire pour déterminer le suivi.

Les données identifiées seront situées sur un PC en réseau, physiquement situé à l'hôpital général de Changi et derrière des pare-feu institutionnels. Les données identifiables individuellement seront conservées à l'hôpital et ne seront pas partagées avec le laboratoire.

Les données seront archivées pour les projets en aval une fois l'étude terminée.