Uma avaliação abrangente do DNA tumoral circulante e das células tumorais circulantes como um marcador preditivo no câncer de pulmão

O câncer de pulmão não está apenas entre os 3 tipos de câncer mais comuns em homens e mulheres, mas também é a principal causa de mortalidade por câncer em Cingapura e nos Estados Unidos. A quimioterapia à base de platina é atualmente o esteio no tratamento medicamentoso para pacientes com câncer de pulmão, embora apenas alivie temporariamente os sintomas relacionados à doença. Recentemente, o uso de terapia direcionada molecularmente levou a uma melhor sobrevida em subconjuntos de pacientes. Em particular, a presença de mutações EGFR ou ALK de biópsias pulmonares prediz taxa de resposta melhorada e sobrevida livre de progressão do uso de inibidores de tirosina quinase ou crizotinibe, respectivamente. É importante ressaltar que as mutações EGFR são mais comuns em tumores de pacientes asiáticos (cerca de 35%) versus não asiáticos (cerca de 10%).

A principal causa de mortalidade em pacientes com cânceres sólidos são as metástases por disseminação via circulação sanguínea. A capacidade de detectar a presença de células tumorais em circulação, mesmo antes da ocorrência de metástases evidentes, evoluiu rapidamente nos últimos anos. A importância prognóstica do DNA tumoral circulante (ctDNA) e das células tumorais circulantes (CTCs) em vários cânceres foi encontrada e esta técnica é amplamente reconhecida como de grande importância clínica e biológica. Este estudo avalia o uso de ctDNA e CTCs na previsão da atividade da doença e resposta a medicamentos em pacientes com câncer de pulmão e serve para complementar os métodos existentes para obter um meio não invasivo e preciso para orientar as decisões de tratamento.

De fato, o uso de ctDNA e CTCs como um marcador para avaliação de risco e monitoramento de tratamento é vantajoso, pois é acessível e pode ser monitorado regularmente de forma não invasiva. Isso ajustará melhor nossos programas de vigilância e tratamento para otimizar os resultados da doença.

Os investigadores desenvolveram um kit de detecção de mutação EGFR que detecta as 3 principais mutações EGFR em níveis ultrassensíveis. Os investigadores aplicaram isso a uma variedade de materiais clínicos, incluindo DNA embebido em parafina fixado em formalina, derrames pleurais, DNA circulante e células tumorais circulantes e descobriram que os kits podem captar essas mutações com alta sensibilidade e especificidade.

Um dispositivo de filtro de membrana de micropeneira para isolar efetivamente as células tumorais circulantes da amostra de sangue total foi desenvolvido pelo Instituto de Bioengenharia e Nanotecnologia. O dispositivo explora a diferença de tamanho entre células cancerígenas e células sanguíneas para obter a captura de células cancerígenas em um filtro de micropeneira com taxa de recuperação > 85% de sangue total de 4,5 ml em 10 minutos, demonstrado com células cancerígenas adicionadas a amostras de sangue total. O dispositivo contém uma matriz de poros densamente compactados (> 8000 poros/mm^2) com um diâmetro de poro otimizado de 10 µm. A regulação de fluidos e a contagem de células são obtidas por um simples bombeamento a vácuo e um microscópio de fluorescência de laboratório. As células capturadas são coradas com anti-EpCAM-PE para CTCs, anti-CD45-FITC para glóbulos brancos e 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para núcleos celulares. As CTCs são identificadas com anti-EpCAM positivo, anti-CD45 negativo e DAPI positivo, caracterizados usando um microscópio de fluorescência.

Portanto, a partir de nossos estudos preliminares, os pesquisadores levantam a hipótese de que nossa tecnologia é útil para isolar células tumorais circulantes e que essas células tumorais circulantes provavelmente se correlacionam com a atividade da doença e não são encontradas em indivíduos saudáveis.

O monitoramento do DNA tumoral circulante e das células tumorais circulantes pode fornecer um tempo de avanço clinicamente valioso na determinação da resposta, em comparação com os métodos radiológicos convencionais.

Uma coorte de pacientes será recrutada para um estudo de coorte longitudinal onde tecido e sangue serão coletados para biomarcadores. Nenhuma intervenção está prevista. O estudo será realizado ao longo de três anos.

Amostras e Consentimento do Paciente

Prospectivamente, ao longo de seis anos (agosto de 2014 a agosto de 2020), cerca de 150 pacientes diagnosticados com câncer de pulmão que forneceram consentimento informado total para este estudo terão tumor e/ou sangue e/ou efusões coletadas. Pacientes de outras localidades podem ser encaminhados para esses locais.

Se os pacientes não consentirem com a coleta de sangue para estudos clínicos, mas consentiram e assinaram o consentimento informado para a coleta de material congelado ou fixado em parafina fixado em formalina para fins de pesquisa, incluindo biópsias, citologia ou ressecções cirúrgicas como parte do formulário de consentimento cirúrgico padrão, tecido tumoral e tecido normal serão coletados do Changi General Hospital. O estadiamento e classificação do tumor foram obtidos a partir da revisão dos relatórios de patologia e avaliação das notas de caso por investigadores clínicos individuais. O consentimento informado por escrito para análise de amostras clínicas coletadas prospectivamente será obtido de todos os pacientes, incluindo o consentimento para obter uma amostra de tecido pulmonar para biópsia para fins de pesquisa. Nenhum outro procedimento adicional é necessário além do procedimento recomendado para remover o tecido do paciente para avaliação do tumor, seja broncoscopia, biópsia guiada por TC ou cirurgia aberta, dependendo da avaliação do médico. Uma vez concluído o procedimento de rotina, um dos tecidos será selecionado para fins de pesquisa. Os "blocos de tecido de pesquisa" serão anonimizados e as lâminas agrupadas para posterior exame/verificação da presença do tumor por um patologista.

Cada paciente em potencial fornecerá 3 tubos de sangue com EDTA de linha de base (total de aproximadamente 30 ml). Urina (~100mL) será coletada ao mesmo tempo para estudo de DNA urinário.

Essas amostras de sangue serão centrifugadas por 10 minutos a 3000 rpm, para coleta de soro e plasma para validação de biomarcadores identificados por análise de microarray, selecionando proteínas candidatas secretadas no sangue.

Derrames (pleural ou peritoneal) serão obtidos como parte de procedimentos terapêuticos de rotina, conforme recomendado pelo médico assistente, onde os fluidos teriam sido descartados. Em nenhum momento o fluido de efusão será obtido para o único propósito deste estudo.

Serão realizados trabalhos downstream em termos de avaliação das CTCs, células mononucleares do sangue periférico, DNA, RNA, proteínas e outros materiais genéticos e moleculares. As técnicas aplicadas incluirão PCR quantitativo, sequenciamento, citometria de fluxo e imunofenotipagem, imuno-histoquímica, hibridização fluorescente in situ, cultura, etc.

Análise mutacional:

O material genético será extraído de 3-5 mL de materiais retidos na peneira e de plasma sanguíneo, bem como material relevante, como efusões ou urina. Isso será analisado por PCR quantitativo usando primers personalizados e/ou sequenciamento. Os materiais genéticos também serão perfilados usando técnicas de sequenciamento de última geração para identificar mutações clinicamente acionáveis, como BRAF, ALK, ROS, RET, etc.

As amostras serão processadas frescas. Qualquer amostra restante será separada em buffy coats e plasma e armazenada em nitrogênio líquido e/ou -80C.

Dados e amostras são desidentificados para processamento laboratorial. Cada local reterá as informações que ligam o paciente à amostra. Isso é necessário para determinar o acompanhamento.

Os dados identificados serão localizados em um PC em rede, localizado fisicamente no Changi General Hospital e atrás de firewalls institucionais. Dados de identificação individual serão retidos no hospital e não serão compartilhados com o laboratório.

Os dados serão arquivados para projetos de downstream assim que o estudo for concluído.