Kattava arvio kiertävästä kasvain-DNA:sta ja kiertävistä kasvainsoluista keuhkosyövän ennakoivana markkerina

Keuhkosyöpä ei ole vain kolmen yleisimmän syöpätyypin joukossa sekä miehillä että naisilla, vaan myös johtava syöpäkuolleisuuden syy Singaporessa ja Yhdysvalloissa. Platinapohjainen kemoterapia on tällä hetkellä päätuki keuhkosyöpäpotilaiden lääkehoidossa, vaikka se lievittää vain tilapäisesti sairauteen liittyviä oireita. Viime aikoina molekulaarisesti kohdistetun hoidon käyttö on johtanut parantuneeseen eloonjäämiseen potilaiden alaryhmissä. Erityisesti EGFR- tai ALK-mutaatioiden esiintyminen keuhkobiopsioista ennustaa parantuneen vastenopeuden ja etenemisvapaan eloonjäämisen tyrosiinikinaasi-inhibiittoreiden tai krisotinibin käytön seurauksena. Tärkeää on, että EGFR-mutaatiot ovat yleisempiä aasialaisten potilaiden kasvaimissa (noin 35 %) verrattuna ei-aasialaisiin (noin 10 %).

Kiinteitä syöpiä sairastavien potilaiden suurin kuolleisuussyy ovat verenkierron kautta leviävät etäpesäkkeet. Kyky havaita kasvainsolujen läsnäolo verenkierrossa jo ennen avoimien etäpesäkkeiden esiintymistä on kehittynyt nopeasti viime vuosina. Kiertävän kasvain-DNA:n (ctDNA) ja kiertävien kasvainsolujen (CTC) prognostinen merkitys useissa syövissä on havaittu, ja tällä tekniikalla on laajalti tunnustettu olevan suuri kliininen ja biologinen merkitys. Tämä tutkimus arvioi ctDNA:n ja CTC:iden käyttöä sairauden aktiivisuuden ja lääkevasteen ennustamisessa keuhkosyöpäpotilailla ja täydentää olemassa olevia menetelmiä ei-invasiivisen ja tarkan keinon ohjaamiseksi hoitopäätöksiä varten.

Itse asiassa ctDNA:n ja CTC:iden käyttö markkerina riskinarvioinnissa ja hoidon seurannassa on edullista, koska se on saatavilla, ja sitä voidaan seurata säännöllisesti ei-invasiivisesti. Tämä räätälöi paremmin seurantaohjelmamme ja hoitomme sairauden tulosten optimoimiseksi.

Tutkijat ovat kehittäneet EGFR-mutaatioiden havaitsemispakkauksen, joka havaitsee 3 pääasiallista EGFR-mutaatiota ultraherkillä tasoilla. Tutkijat ovat soveltaneet tätä useisiin kliinisiin materiaaleihin, mukaan lukien formaliinilla kiinnitetty parafiiniin upotettu DNA, keuhkopussin effuusiot, kiertävä DNA sekä kiertävät kasvainsolut, ja havainneet, että sarjat voivat poimia nämä mutaatiot erittäin herkästi ja spesifisinä.

Biotekniikan ja nanoteknologian instituutti on kehittänyt mikroseulakalvosuodatuslaitteen, joka eristää tehokkaasti kiertävät kasvainsolut kokoverinäytteestä. Laite hyödyntää syöpäsolujen ja verisolujen välistä kokoeroa saavuttaakseen syöpäsolujen talteenoton mikroseulasuodattimella yli 85 %:n palautumisasteella 4,5 ml:n kokoverestä 10 minuutissa, kun syöpäsoluja on lisätty kokoverinäytteisiin. Laite sisältää tiiviisti pakatun huokosryhmän (> 8000 huokoset/mm^2), jonka optimoitu huokoshalkaisija on 10 µm. Nesteen säätely ja solujen laskenta saavutetaan yksinkertaisella tyhjiöpumppauksella ja laboratoriofluoresenssimikroskoopilla. Siepatut solut värjätään anti-EpCAM-PE:llä CTC:ille, anti-CD45-FITC:llä valkosoluille ja 4',6-diamidino-2-fenyyli-indolilla (DAPI) soluytimille. CTC:t tunnistetaan anti-EpCAM-positiivisilla, anti-CD45-negatiivisilla ja DAPI-positiivisilla, karakterisoidaan fluoresenssimikroskoopilla.

Tästä syystä tutkijat olettavat alustavien tutkimustemme perusteella, että teknologiamme on hyödyllinen kiertävien kasvainsolujen eristämisessä ja että nämä kiertävät kasvainsolut korreloivat todennäköisesti sairauden aktiivisuuden kanssa eikä niitä löydy terveiltä henkilöiltä.

Kiertävän kasvain-DNA:n ja kiertävien kasvainsolujen seuranta voi tarjota kliinisesti arvokkaan läpimenoajan vasteen määrittämisessä tavanomaisiin radiologisiin menetelmiin verrattuna.

Potilasjoukko rekrytoidaan pitkittäiseen kohorttitutkimukseen, jossa kerätään kudosta ja verta biomarkkereita varten. Mitään interventiota ei ole suunniteltu. Tutkimus toteutetaan kolmen vuoden ajan.

Potilasnäytteet ja suostumus

Tulevaisuudessa kuuden vuoden aikana (elokuu 2014 - elokuu 2020) noin 150 potilaalta, joilla on diagnosoitu keuhkosyöpä ja jotka antavat täyden tietoisen suostumuksen tähän tutkimukseen, kerätään kasvain ja/tai verta ja/tai effuusiota. Muilta paikkakunnilta tulevat potilaat voidaan ohjata näille sivustoille.

Jos potilaat eivät suostu veren keräämiseen kliinisiä tutkimuksia varten, mutta ovat antaneet suostumuksensa ja allekirjoittaneet tietoon perustuvan operatiivisen suostumuksen pakastetun tai formaliinilla kiinnitetyn parafiinimateriaalin keräämiseen tutkimustarkoituksiin, mukaan lukien biopsiat, sytologia tai kirurgiset resektiot osana vakiomuotoista kirurgista suostumuslomaketta, kasvainkudos ja normaali kudos kerätään Changin yleissairaalasta. Kasvaimen vaiheet ja luokittelu saatiin yksittäisten kliinikon tutkijoiden patologiaraporttien tarkastelusta ja tapausmuistiinpanojen arvioinnista. Kaikilta potilailta hankitaan kirjallinen tietoinen suostumus prospektiivisesti kerättyjen kliinisten näytteiden analysointiin, mukaan lukien suostumus biopsian keuhkokudosnäytteen ottamiseen tutkimustarkoituksiin. Muita lisätoimenpiteitä ei tarvita kuin suositeltu toimenpide potilaan kudoksen poistamiseksi kasvaimen arviointia varten, olipa kyseessä bronkoskopia, TT-ohjattu biopsia tai avoin leikkaus lääkärin arvion mukaan. Kun rutiinitoimenpiteet on suoritettu, yksi kudoksista valitaan tutkimustarkoituksiin. "Tutkimuksen kudoslohkot" anonymisoidaan ja objektilasit eritetään myöhempää tutkimusta/tuumorin läsnäolon varmentamista varten patologin toimesta.

Jokainen mahdollinen potilas toimittaa lähtötilanteessa 3 EDTA-veriputkea (yhteensä noin 30 ml). Virtsa (~100 ml) kerätään samaan aikaan virtsan DNA:n tutkimista varten.

Näitä verinäytteitä sentrifugoidaan 10 minuuttia nopeudella 3 000 rpm seerumin ja plasman keräämiseksi mikrosiruanalyysillä tunnistettujen biomarkkerien validointia varten, jolloin valitaan verestä erittyvät kandidaattiproteiinit.

Effuusiot (keuhkopussin tai peritoneaaliset) saadaan osana rutiininomaisia ​​terapeuttisia toimenpiteitä hoitavan lääkärin suosittelemalla tavalla, jos nesteet olisi muutoin hävitetty. Effuusionestettä ei saada missään vaiheessa tämän tutkimuksen yksinomaista tarkoitusta varten.

Myöhemmin suoritetaan CTC:iden, perifeerisen veren mononukleaarisolujen, DNA:n, RNA:n, proteiinin ja muiden geneettisten ja molekyylisten materiaalien arviointia koskeva työ. Käytettyihin tekniikoihin kuuluu kvantitatiivinen PCR, sekvensointi, virtaussytometria ja immunofenotyypitys, immunohistokemia, fluoresoiva in situ -hybridisaatio, viljely jne.

Mutaatioanalyysi:

Geneettistä materiaalia uutetaan 3-5 ml:sta seulalle jääneitä materiaaleja ja veriplasmasta sekä asiaankuuluvasta materiaalista, kuten effuusioista tai virtsasta. Tämä analysoidaan kvantitatiivisella PCR:llä käyttämällä räätälöityjä alukkeita ja/tai sekvensointia. Geneettisiä materiaaleja profiloidaan myös käyttämällä seuraavan sukupolven sekvensointitekniikoita kliinisesti toimivien mutaatioiden, kuten BRAF, ALK, ROS, RET jne., tunnistamiseksi.

Näytteet käsitellään tuoreina. Jäljelle jäänyt näyte erotetaan buffy coatiksi ja plasmaksi ja varastoidaan nestetypessä ja/tai -80 °C:ssa.

Tiedot ja näytteet poistetaan laboratoriokäsittelyä varten. Jokainen sivusto säilyttää tiedot, jotka yhdistävät potilaan näytteeseen. Tämä on tarpeen seurannan määrittämiseksi.

Tunnistetut tiedot sijoitetaan verkkoon kytketylle PC:lle, joka sijaitsee fyysisesti Changin yleissairaalassa ja laitosten palomuurien takana. Yksilöllisesti tunnistettavat tiedot säilytetään sairaalassa, eikä niitä jaeta laboratorion kanssa.

Tiedot arkistoidaan loppupään projekteihin tutkimuksen valmistuttua.