小児結核性髄膜炎の診断を改善するための新しいバイオマーカーベースのアプローチの評価 (TBMBIOMARKER)

EDCTP2 の重要性と関連性 結核 (TB) と闘うためのツールの開発に多大な努力が続けられているにもかかわらず、2017 年には世界中で 1,000 万人がこの病気を発症しており、この病気は約 160 万人の死亡の原因となっています (1)。 2017 年には推定 100 万人の子供が結核にかかりました (1, 2)。 南アフリカ、ナイジェリア、インド、中国、インドネシア、フィリピン、パキスタン、バングラデシュを含むアフリカまたはアジアの 8 か国が、世界の結核総負荷の 3 分の 2 を占めています (1)。 南アフリカにおける結核の発生率は、1990 年の 301 件/100,000 から 2007 年には 948/100,000 に増加しました (3)。 結核の負担は、南アフリカや他のアフリカ諸国で猛威を振るっている HIV パンデミックによって悪化しています。 結核性髄膜炎 (TBM) は結核の最も深刻な形態であり、主に幼児期に発生し、診断と適切な治療の開始が遅れるため、罹患率と死亡率が高くなります (4)。 TBM は、南アフリカの西ケープ州で最も一般的なタイプの細菌性髄膜炎です (5)。

新しい TBM 診断テストが必要です。 進行中の研究にもかかわらず、TBM の初期の費用対効果の高い診断ツールは不足しています (6)。 脳脊髄液 (CSF) 中の結核菌 (Mtb) の検出は、TBM を診断するためのゴールド スタンダードです。 残念ながら、TBM に対する塗抹標本検査と培養の感度は低いです (7, 8)。 採用した参照標準に応じて、TBM に対する GeneXpert テスト (Cepheid Inc、米国) の感度は約 50 ～ 60% であり、ある研究で遠心分離された CSF を使用した場合は 72% に改善されました (9)。 しかし、最近発表された HIV 陽性の成人を対象とした研究では、GeneXpert は 43% または 45% の感度で実行されましたが、培養では 43% または 45%、GeneXpert Ultra では 70% または 95% でした。 2 つの参照標準が使用されました (10)。 南アフリカ全体で GeneXpert テストが比較的頻繁に展開されているにもかかわらず、このテストは現在、主に中央研究所で提供されています。 他のアフリカ諸国でのテストの利用は限られています。 TB の診断は、感度の低い症状のスクリーニングと塗抹標本の顕微鏡検査に依存しており、特に地方の保健センターではそうです。 多くの場合、Mtb 培養施設は紹介レベルの研究所でのみ利用可能であり、結果には最大 42 日かかる場合があります。 何度も医療機関を受診する必要があるため、経過観察の機会が失われ、診断が遅れ、結核の蔓延と肺の損傷が進行します。 特にTBMの場合、適切な診断は、高等教育レベルの紹介センターへの入院時にのみ行われます。 日常的な臨床診療では、診断は主に臨床所見、CSF に関する複数の臨床検査、画像所見、および一般的な鑑別診断の除外の組み合わせに基づいています (11)。 これらの技術のほとんどは、サハラ以南のアフリカの大部分で、負荷が高く、資源が限られている多くの環境では利用できません。 一次および二次医療施設で診察を受けた子供は、南アフリカの比較的設備の整った環境でTBMの最終的な診断が行われる前に、最大6回の訪問まで、複数の機会を逃すことがよくあります(12)。 CSF からの所見は非常に変わりやすい (13)。 最近、国際的な専門家は、文献 (7、8、13、16、17) の多くの異なる定義を置き換えるために、将来の研究 (14、15) で採用されるべき新しい統一されたケース定義を提案しました。 したがって、TBM の診断には新しい検査が緊急に必要です。

サハラ以南のアフリカでは、ポイントオブケア (POC) またはベッドサイド診断ツールが必要です。 TBM の新しい検査は、迅速で、POC またはベッドサイドで簡単に実行でき、アフリカ諸国の資源の乏しい環境での使用に適している必要があります。 したがって、このようなテストでは、専門家の操作を必要とする実験室の機器を使用しないことが望ましいです。 彼らは、看護師や地域の医療従事者が使用するのに適した、バッテリーまたは太陽電池で動作する携帯用デバイスを使用する必要があります(18)。 ヒトの免疫応答に基づく診断は、重要な追加機能を提供する可能性があり、POC またはベッドサイドの診断ツールに簡単に変換できます。

TBM の診断候補としてホスト CSF タンパク質シグネチャ。 研究者らは、TBM の診断候補として、TBM が疑われる子供の CSF サンプルで検出された宿主マーカーの可能性を調査しました (19)。 研究者らは、標準の BioPlex 27plex マルチプレックス サイトカイン キット (Bio Rad Laboratories) に存在する宿主バイオマーカーのレベルと、CSF および血清サンプル中の他のタンパク質バイオマーカーを評価しました。 Glucore Omics エクスプローラーを使用した教師なしの階層的クラスタリングと主成分分析により、CSF で検出されたバイオマーカーによる TBM 患者の有意なクラスタリングが明らかになりました。

血管内皮増殖因子 (VEGF)、インターロイキン (IL)-13、および抗菌ペプチドであるカテリシジン LL-37 を含む 3 マーカーの宿主タンパク質バイオシグネチャーは、TBM の診断バイオシグネチャーとしての可能性を示しました (国際特許出願: PCT/IB2015/052751)。 ) (19)、0.91 の受信者操作特性曲線 (AUC) の下の領域で TBM を診断し、感度は 52% ですが、特異度は 95% と良好です。 このバイオシグネチャーが発表されて以来、研究者らは、アフリカの 5 つの異なる国 (南アフリカ、ナミビア、マラウイ、ウガンダ、エチオピア) で、活動性肺結核の疑いのある成人の血清および血漿サンプル中の 70 を超える宿主バイオマーカーの診断の可能性を評価してきました。 EDCTP が資金を提供する試験 (AE-TBC)。 研究者らは、結核の強力な診断の可能性を持つ 6 および 7 マーカータンパク質のバイオシグネチャーを特定し、特許を取得し (PCT/IB2015/051435 および PCT/IB2017/052142)、公開しました (20、21)。

より最近の研究 (南アフリカ仮特許出願; Manyelo et al 2019、印刷中) では、研究者は、成人タンパク質バイオシグネチャーを構成する宿主バイオマーカーの少なくともいくつかが TBM 診断に役立つ可能性があるという仮説を立てました。 南アフリカ技術革新庁 (PI: Chegou) の資金提供を受けて、研究者らは、西ケープ州のタイガーバーグ学術病院で、TBM の疑いがある子供たちの新しいコホートを前向きに登録し、これらの CSF サンプルで 66 の宿主バイオマーカーの濃度を決定しました。子供達。 調査員は、この新しい研究の検証目的で、以前の TBM の CSF バイオシグネチャー (VEGF、IL-13、およびカテリシジン LL-37) (19) を構成する 3 つのバイオマーカーも含めました。合計 69 の宿主タンパク質バイオマーカー。

VEGF (AUC 0.81) を除いて、以前の 3 マーカー シグネチャの個々のマーカーの精度は低かった (IL-13 および LL-37 の AUC はそれぞれ 0.58 および 0.55) が、組み合わせて使用​​すると、 3 マーカー モデルによる TBM と非 TBM の識別が確認されました [AUC 0.67 (95% CI: 0.52-0.83)。 75% の感度と 65% の特異性]。 追加のマーカーのうち 47 個は、TBM グループと非 TBM グループの間で有意差を示し (Mann Whitney U 検定)、28 個は個々のマーカーとしても強力な診断の可能性を示しました (AUC ≥ 0.80)。 これらのマーカーには、インターフェロン (IFN)-γ、CCL18(MIP-4)、CXCL9、CCL1、CCL5(RANTES)、IL-6、腫瘍壊死因子 (TNF)-α、ミエロペルオキシダーゼ (MPO)、マトリックスメタロプロテイナーゼ 9 (MMP) が含まれます。 、MMP-8、補体 C2 (CC2)、IL-10、総プラスミノーゲン活性化因子阻害剤 1 (PAI-1)、CXCL8、IL-1β、α-2-アンチトリプシン(A1AT)、CXCL10、顆粒球コロニー刺激因子 (G- CSF)、CC4、CC4b、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)、血小板由来増殖因子 (PDGF)-AB/BB、アポリポタンパク質 A1 (apoA1)、マンノース結合レクチン (MBL)、フェリチン、CC5a、血清アミロイド P (SAP)、および CC5。

これらのバイオマーカーの組み合わせを調査し、線形判別分析 (LDA) モデルを使用しました。 可溶性細胞内接着分子 (sICAM)-1、MPO、CXCL8、および IFN-γ を含む 4 マーカーの CSF バイオシグネチャーは、0.97 の AUC (95% CI: 0.92-1.00) で TBM と診断され、 感度は 87% (20/23)、特異度は 95.8% (23/24) です。 Leave-one-out クロス検証の後、4 マーカーのバイオシグネチャーの感度と特異性に変化はありませんでした。 より良いカットオフ値の選択による 4 マーカーのバイオシグネチャーのさらなる最適化により、それぞれ 96% および 96% の感度と特異性が得られました。

VEGF は単一マーカー分析で良好に機能したため (19)、研究者は VEGF を含む他のバイオシグネチャーの潜在的な精度を評価しました。 VEGF、IFN-γ、および MPO を含む 3 マーカー モデルは、TBM の子供と TBM のない子供を高い精度で識別しました。 Leave-one-out 交差検証と最良のカットオフ値の最適化では、3 マーカー VEGF ベースのシグネチャの感度と特異性は、それぞれ 92% と 100% でした。

TBMの診断候補としての血清宿主タンパク質シグネチャ。 CSFサンプルで調査された69の宿主マーカーはすべて、Luminexマルチプレックスプラットフォームを使用して血清サンプルでも調査されました。 17 の検体 [sVCAM1、CCL2、IL-4、TNF-α、CCL4、アディプシン、SAP、CC5、CFH、G-CSF、IL-10、Apo-CIII、IL-17A、PAI-1(合計）、PDGF AB / BB、MBL、およびNCAM1]は有意に異なっていました（p <0.05; マン・ホイットニーの U 検定) で、TBM のある子供とない子供の間で行われます。 個々の血清バイオマーカーの診断の可能性が ROC 曲線分析によって評価されたとき、13 のマーカーが有望な AUC ≥ 0.70 でした。 LDA は、TBM の最適な診断が 3 つのマーカーを使用して達成されることを示しました。 TBM の診断のための最も正確な 3 マーカー血清バイオシグネチャ [アジプシン (補体因子 D)、Ab42、および IL-10] は、0.84 の AUC (95% CI: 0.73-0.96) で TBM を診断しました。 82.6% (19/23) の感度と 75% (18/24) の特異性。 Leave-one-out 交差検証では、感度は 82.6% (19/23) のままで、特異性は 70.3% (17/24) に減少しました。 より良いカットオフ値を選択してバイオシグネチャーをさらに最適化すると、感度と特異度がそれぞれ 83% と 83% 向上しました。

バイオセンサーベースの診断プラットフォーム。 TBM の最高のパフォーマンスを発揮する CSF および血清バイオマーカーは、SU の工学部で開発される新しい POC 診断プラットフォームに組み込まれます。 研究者らは、ZnO ナノワイヤを使用したプロトタイプの圧電センサーと、エレクトロスピニングされたナノファイバー メッシュに基づく抵抗感知素子を開発しました (22)。 デバイスは、大腸菌の検出に成功しました (23)。 研究者はまた、この技術を使用して、オートファジー活性のバイオマーカーである少量のタンパク質 LC3 を検出しました。最近のマスター プロジェクトの一環として、このプラットフォームは、fg/ml 範囲の主要な TB バイオマーカーである IFN-γ を検出することができました。したがって、その潜在的な高感度を示しています。

同様のアプローチを使用して、血清またはCSFで最大4つのバイオマーカーを検出できるマルチバイオマーカーベースのプロトタイプテストを開発し、TBMが疑われる300人の新しく採用された子供でテストを前向きに評価します(目的3)。

全体的な目的 主な目的は、以前に同定された宿主血清および CSF バイオマーカーを検証し、これらのバイオマーカーに基づいて、TBM の診断のためのバイオセンサーベースの POC テストを開発することです。

研究者らは、以前の研究で可能性を示した相関バイオマーカーのパネルを特定することを提案しています。 これは、Luminex などの実験室ベースの技術プラットフォームからバイオセンサーベースの技術を使用した POC テストへの移行が、いくつかのマーカーの損失に直面する可能性が高いため、相互に置換できるバイオマーカーを特定するために行われます。技術的な理由、または抗体の所有権やコストの問題により一部のマーカーが利用できないためです。 高度に相関するマーカーは、そのようなマーカーを置き換えることができます。 研究者は、POC 診断テスト プラットフォームでどのバイオ マーカーのセットが最も効果的かをテストします。 最後に、研究者は、以下に説明するように、TBMが疑われる300人の研究参加者の新しいコホートでプロトタイプテストを前向きに評価します。

プロトタイプ試験は、CSFまたは血清バイオマーカーの最良のバイオシグネチャーに基づいており、どちらが最も優れているかに応じて決定されます。 ただし、血清バイオ マーカーに基づくテストを開発することは、CSF サンプルの収集が難しいため、有利な場合があります。 さらに、血清バイオマーカーに基づく検査は、指刺し検査に簡単に変換できる可能性があり、リソースに制約のある設定での実装がはるかに容易になります。 研究者は現在、EDCTP2 が資金提供するコンソーシアム (www.screen-tb.eu) の一環として、血清サンプルで発見および検証された宿主バイオマーカーに基づく成人結核のフィンガープリック スクリーニング テストを評価しています。

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