Evaluación de nuevos enfoques basados ​​en biomarcadores para mejorar el diagnóstico de la meningitis tuberculosa infantil (TBMBIOMARKER)

IMPORTANCIA Y RELEVANCIA PARA EDCTP2 A pesar de los considerables esfuerzos en curso en el desarrollo de herramientas para combatir la tuberculosis (TB), la enfermedad fue responsable de aproximadamente 1,6 millones de muertes, con 10 millones de personas que desarrollaron la enfermedad en todo el mundo en 2017 (1). Se estima que un millón de niños se enfermaron de TB en 2017 (1, 2). Ocho países de África o Asia, incluidos Sudáfrica, Nigeria, India, China, Indonesia, Filipinas, Pakistán y Bangladesh, representaron dos tercios de la carga total mundial de TB (1). La incidencia de tuberculosis en Sudáfrica aumentó de 301 casos nuevos/100 000 en 1990 a 948/100 000 en 2007 (3). La carga de la TB se ve agravada por la pandemia del VIH, que prolifera en Sudáfrica y otros países africanos. La meningitis tuberculosa (TBM) es la forma más grave de TB, ocurre principalmente durante la primera infancia y tiene una alta morbilidad y mortalidad, debido al retraso en el diagnóstico y el inicio de la terapia adecuada (4). La TBM es el tipo más común de meningitis bacteriana en la Provincia Occidental del Cabo de Sudáfrica (5).

Se necesitan nuevas pruebas de diagnóstico TBM. A pesar de la investigación en curso, faltan herramientas de diagnóstico tempranas y rentables para TBM (6). La detección de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en líquido cefalorraquídeo (LCR) es el estándar de oro para el diagnóstico de TBM. Desafortunadamente, la sensibilidad tanto de la baciloscopía como del cultivo para TBM es baja (7, 8). Según el estándar de referencia empleado, la sensibilidad de la prueba GeneXpert (Cepheid Inc, EE. UU.) para TBM es de aproximadamente 50-60 % y mejoró a 72 % cuando se usó LCR centrifugado en un estudio (9). Sin embargo, en un estudio publicado más recientemente realizado en adultos VIH positivos, GeneXpert funcionó con una sensibilidad del 43 % o 45 %, en comparación con el 43 % o 45 % para cultivo y el 70 % o 95 % para GeneXpert Ultra, dependiendo de qué de los dos estándares de referencia (10). A pesar de la implementación relativamente alta de la prueba GeneXpert en Sudáfrica, actualmente la prueba se ofrece principalmente en laboratorios centralizados. La disponibilidad de la prueba en otros países africanos es limitada. El diagnóstico de TB se basa en la detección de síntomas y la baciloscopía de baja sensibilidad, especialmente en los centros de salud rurales. Las instalaciones de cultivo de Mtb a menudo solo están disponibles en laboratorios de nivel de referencia y los resultados pueden demorar hasta 42 días. La necesidad de múltiples visitas de atención médica conduce a la pérdida del seguimiento y al retraso en el diagnóstico, lo que alimenta la propagación de la TB y el daño pulmonar avanzado. En el caso de la TBM en particular, el diagnóstico adecuado solo se realiza al ingreso en un centro de referencia de nivel terciario. En la práctica clínica habitual, el diagnóstico se basa principalmente en una combinación de hallazgos clínicos, múltiples pruebas de laboratorio en el LCR, hallazgos de imagen y la exclusión de diagnósticos diferenciales comunes (11). La mayoría de estas técnicas no están disponibles en muchos entornos de alta carga pero con recursos limitados en la mayor parte del África subsahariana. Los niños atendidos en centros de salud primarios y secundarios a menudo tienen múltiples oportunidades perdidas, hasta seis visitas, antes de que se realice un diagnóstico final de TBM en un entorno con recursos relativamente buenos en Sudáfrica (12). Los hallazgos del LCR pueden ser muy variables (13). Recientemente, expertos internacionales han propuesto nuevas definiciones uniformes de casos que deberían emplearse en investigaciones futuras (14, 15) para reemplazar las muchas definiciones diferentes en la literatura (7, 8, 13, 16, 17). Por lo tanto, se necesitan con urgencia nuevas pruebas para el diagnóstico de TBM.

Se necesitan herramientas de diagnóstico en el punto de atención (POC) o de cabecera en África subsahariana. Cualquier nueva prueba para TBM debe ser rápida, fácil de realizar en el POC o junto a la cama, y ​​adecuada para su uso en entornos de escasos recursos en países africanos. Tales pruebas deben, por lo tanto, preferiblemente no utilizar instrumentos de laboratorio que requieran especialistas para operar. Deben utilizar dispositivos de mano portátiles que funcionen con pilas o con energía solar, adecuados para que los utilicen las enfermeras y los trabajadores sanitarios de la comunidad (18). Los diagnósticos basados ​​en la respuesta inmunitaria humana pueden proporcionar adiciones importantes, que se convierten fácilmente en herramientas de diagnóstico POC o de cabecera.

Firmas de proteínas del LCR del huésped como candidatas de diagnóstico para TBM. Los investigadores investigaron el potencial de los marcadores del huésped detectados en muestras de LCR de niños con sospecha de TBM como candidatos para el diagnóstico de TBM (19). Los investigadores evaluaron los niveles de los biomarcadores del huésped presentes en un kit estándar de citoquinas múltiplex BioPlex 27plex (Bio Rad Laboratories) y otros biomarcadores de proteínas en muestras de LCR y suero. Un agrupamiento jerárquico no supervisado y un análisis de componentes principales, utilizando el explorador Glucore Omics, reveló un agrupamiento significativo de pacientes con TBM por los biomarcadores detectados en el LCR.

Una biofirma de proteína huésped de 3 marcadores que comprende factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), interleucina (IL)-13 y el péptido antibacteriano catelicidina, LL-37, mostró potencial como biofirma de diagnóstico para TBM (solicitud de patente internacional: PCT/IB2015/052751 ) (19), diagnosticando TBM con un área bajo la curva de características del operador del receptor (AUC) de 0,91, con una sensibilidad del 52%, pero con una buena especificidad del 95%. Desde la publicación de esta biofirma, los investigadores han evaluado el potencial diagnóstico de >70 biomarcadores del huésped en muestras de suero y plasma de adultos con sospecha de TB pulmonar activa en 5 países africanos diferentes (Sudáfrica, Namibia, Malawi, Uganda y Etiopía) en un ensayo financiado por EDCTP (AE-TBC). Los investigadores identificaron, patentaron (PCT/IB2015/051435 y PCT/IB2017/052142) y publicaron firmas biológicas de proteínas de 6 y 7 marcadores con un fuerte potencial diagnóstico para la TB (20, 21).

En un estudio más reciente (Solicitud de patente provisional de Sudáfrica; Manyelo et al 2019, en prensa), los investigadores plantearon la hipótesis de que al menos algunos de los biomarcadores del huésped que comprenden nuestras firmas biológicas de proteínas adultas pueden ser útiles para el diagnóstico de TBM. Financiados por la Agencia de Innovación Tecnológica de Sudáfrica (PI: Chegou), los investigadores inscribieron prospectivamente una nueva cohorte de niños sospechosos de tener TBM en el Tygerberg Academic Hospital, Western Cape, y determinaron las concentraciones de 66 biomarcadores del huésped, en muestras de LCR de estos niños. Los investigadores también incluyeron los 3 biomarcadores que componían nuestra biofirma previa en LCR para TBM (VEGF, IL-13 y catelicidina LL-37) (19) con fines de validación en este nuevo estudio; un total de 69 biomarcadores de proteínas huésped.

Con la excepción de VEGF (AUC de 0,81), la precisión de los marcadores individuales en la firma anterior de 3 marcadores fue deficiente (AUC de 0,58 y 0,55, respectivamente, para IL-13 y LL-37), pero cuando se usa en combinación, la Se confirmó la discriminación entre TBM y no TBM por el modelo de 3 marcadores [AUC de 0,67 (IC 95%: 0,52-0,83); sensibilidad del 75% y especificidad del 65%]. Cuarenta y siete de los marcadores adicionales mostraron diferencias significativas entre los grupos TBM y sin TBM (prueba U de Mann Whitney), y 28 mostraron un gran potencial diagnóstico, incluso como marcadores individuales (AUC ≥ 0,80). Estos marcadores incluyen interferón (IFN)-γ, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, factor de necrosis tumoral (TNF)-α, mieloperoxidasa (MPO), matriz metaloproteinasa 9 (MMP) , MMP-8, complemento C2 (CC2), IL-10, inhibidor 1 del activador del plasminógeno total (PAI-1), CXCL8, IL-1β, alfa-2-antitripsina (A1AT), CXCL10, factor estimulante de colonias de granulocitos (G- LCR), CC4, CC4b, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)-AB/BB, apolipoproteína A1 (apoA1), lectina de unión a manosa (MBL), ferritina, CC5a, amiloide sérico P (SAP) y CC5.

Se investigaron combinaciones de estos biomarcadores utilizando modelos de análisis discriminante lineal (LDA). Una firma biológica de LCR de 4 marcadores que comprende la molécula de adhesión intracelular soluble (sICAM)-1, MPO, CXCL8 e IFN-γ diagnosticó TBM con un AUC de 0,97 (IC del 95 %: 0,92-1,00), con una sensibilidad del 87% (20/23) y una especificidad del 95,8% (23/24). Después de la validación cruzada de exclusión, no hubo cambios en la sensibilidad y especificidad de la firma biológica de 4 marcadores. La optimización adicional de la biofirma de 4 marcadores mediante la selección de mejores valores de corte resultó en una sensibilidad y especificidad del 96 % y 96 %, respectivamente.

Dado que VEGF se desempeñó bien en los análisis de un solo marcador (19), los investigadores evaluaron la precisión potencial de otras firmas biológicas que incluían VEGF. Un modelo de 3 marcadores que comprende VEGF, IFN-γ y MPO discriminó con alta precisión entre los niños con y sin TBM. En la validación cruzada de exclusión y las optimizaciones de los mejores valores de corte, la sensibilidad y la especificidad de la firma basada en VEGF de 3 marcadores fueron del 92 % y del 100 %, respectivamente.

Firmas de proteínas séricas del huésped como candidatos diagnósticos para TBM. Los 69 marcadores de host investigados en muestras de LCR también se investigaron en muestras de suero utilizando la plataforma multiplex Luminex. Los niveles séricos medios de 17 analitos [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, adipsin, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( total), PDGF AB/BB, MBL y NCAM1] fueron significativamente diferentes (p<0,05; Prueba U de Mann Whitney) entre niños con y sin TBM. Cuando se evaluó el potencial diagnóstico de los biomarcadores séricos individuales mediante el análisis de la curva ROC, 13 de los marcadores tenían un AUC prometedor ≥ 0,70. LDA demostró que el diagnóstico óptimo de TBM se logró utilizando 3 marcadores. La biofirma sérica de 3 marcadores más precisa para el diagnóstico de TBM [adipsina (factor D del complemento), Ab42 e IL-10] diagnosticó TBM con un AUC de 0,84 (IC del 95 %: 0,73-0,96), una sensibilidad del 82,6% (19/23) y una especificidad del 75% (18/24). En la validación cruzada de exclusión, la sensibilidad se mantuvo en 82,6 % (19/23) y la especificidad disminuyó a 70,3 % (17/24). La optimización adicional de la firma biológica mediante la selección de mejores valores de corte resultó en una sensibilidad y especificidad mejoradas del 83 % y 83 %, respectivamente.

Plataforma de diagnóstico basada en biosensores. Los biomarcadores de LCR y suero de mejor rendimiento para TBM se incorporarán a una nueva plataforma de diagnóstico POC que se desarrollará en la Facultad de Ingeniería, SU. Los investigadores han desarrollado un prototipo de sensor piezoeléctrico utilizando nanocables de ZnO, así como un elemento de detección resistivo basado en una malla de nanofibras electrohiladas (22). El dispositivo detectó con éxito E. coli (23). Los investigadores también utilizaron esta técnica para detectar pequeñas cantidades de la proteína LC3, un biomarcador de la actividad de la autofagia y, como parte de un proyecto de maestría reciente, la plataforma fue capaz de detectar IFN-γ, un biomarcador clave de la TB en rangos de fg/ml. demostrando así su potencial alta sensibilidad.

Usaremos un enfoque similar para desarrollar una prueba prototipo basada en múltiples biomarcadores que sea capaz de detectar hasta 4 biomarcadores en suero o LCR, y evaluaremos prospectivamente la prueba en 300 niños recién reclutados con sospecha de TBM (Objetivo 3).

OBJETIVO GENERAL El objetivo principal es validar los biomarcadores de suero y LCR del huésped previamente identificados y desarrollar una prueba POC basada en biosensores para el diagnóstico de TBM, basada en estos biomarcadores.

Los investigadores proponen identificar un panel de biomarcadores correlacionados que mostraron potencial en estudios previos. Esto se hará para identificar biomarcadores que puedan sustituirse entre sí, ya que es probable que la transición de una plataforma tecnológica basada en laboratorio como Luminex a una prueba POC que utiliza una tecnología basada en biosensores se enfrente a la pérdida de algunos de los marcadores. debido a razones técnicas o debido a la falta de disponibilidad de algunos de los marcadores debido a la propiedad del anticuerpo o problemas de costo. Los marcadores altamente correlacionados pueden entonces sustituir dichos marcadores. Los investigadores probarán qué conjunto de biomarcadores funciona mejor en la plataforma de pruebas de diagnóstico POC. Finalmente, los investigadores evaluarán la prueba prototipo de forma prospectiva en una nueva cohorte de 300 participantes del estudio con sospecha de TBM, como se describe a continuación.

La prueba prototipo se basará en la mejor firma biológica de LCR o biomarcadores séricos, según cuál se desempeñe mejor. Sin embargo, desarrollar la prueba en base a biomarcadores séricos puede ser ventajoso ya que las muestras de LCR son difíciles de recolectar. Además, una prueba basada en biomarcadores séricos se puede convertir fácilmente en una prueba basada en punción digital, que será mucho más fácil de implementar en entornos con recursos limitados. Los investigadores están evaluando actualmente una prueba de detección por punción digital para la TB en adultos basada en biomarcadores del huésped descubiertos y validados en muestras de suero como parte de un consorcio financiado por EDCTP2 (www.screen-tb.eu).

Referencias

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