改进儿童结核性脑膜炎诊断的基于生物标志物的新方法的评估 (TBMBIOMARKER)

对 EDCTP2 的重要性和相关性 尽管在开发抗击结核病 (TB) 的工具方面付出了相当大的努力，但这种疾病导致了大约 160 万人死亡，2017 年全球有 1000 万人患上这种疾病 (1)。 2017 年估计有 100 万儿童患上结核病 (1, 2)。 非洲或亚洲的八个国家，包括南非、尼日利亚、印度、中国、印度尼西亚、菲律宾、巴基斯坦和孟加拉国，占世界结核病总负担的三分之二 (1)。 南非的结核病发病率从 1990 年的 301 例新病例/100,000 上升到 2007 年的 948/100,000 (3)。 结核病负担因在南非和其他非洲国家肆虐的艾滋病毒大流行而恶化。 结核性脑膜炎 (TBM) 是最严重的结核病形式，主要发生在儿童早期，并且由于延迟诊断和开始适当治疗而具有高发病率和死亡率 (4)。 TBM 是南非西开普省最常见的细菌性脑膜炎类型 (5)。

需要新的 TBM 诊断测试。 尽管正在进行研究，但缺乏用于 TBM 的早期且具有成本效益的诊断工具 (6)。 脑脊液（CSF）中结核分枝杆菌（Mtb）的检测是诊断TBM的金标准。 不幸的是，涂片显微镜检查和 TBM 培养的敏感性都很低 (7, 8)。 根据所使用的参考标准，GeneXpert 测试（Cepheid Inc，美国）对 TBM 的灵敏度约为 50-60%，并且在一项研究中使用离心 CSF 时提高到 72% (9)。 然而，在最近发表的一项针对 HIV 阳性成人的研究中，GeneXpert 的灵敏度为 43% 或 45%，而培养的灵敏度为 43% 或 45%，而 GeneXpert Ultra 的灵敏度为 70% 或 95%，具体取决于哪个使用了两个参考标准 (10)。 尽管 GeneXpert 测试在南非的推广率相对较高，但该测试目前主要在集中实验室提供。 该测试在其他非洲国家的可用性有限。 结核病的诊断依赖于敏感性较差的症状筛查和涂片显微镜检查，尤其是在农村卫生中心。 Mtb 培养设施通常只能在转诊级实验室使用，结果可能需要长达 42 天的时间。 多次就诊的需要会导致失访和延误诊断，从而加剧结核病的传播和严重的肺损伤。 特别是在 TBM 的情况下，只有在进入三级转诊中心时才能做出正确的诊断。 在常规临床实践中，诊断主要基于临床发现、CSF 多项实验室检查、影像学发现和排除常见鉴别诊断的组合 (11)。 在撒哈拉以南非洲大部分地区的许多高负担但资源有限的环境中，大多数这些技术都不可用。 在南非资源相对充足的环境中最终诊断出 TBM 之前，在初级和二级医疗机构就诊的儿童通常会错失多次机会，多达六次就诊 (12)。 CSF 的结果可能变化很大 (13)。 最近，国际专家提出了新的统一案例定义，应该在未来的研究中使用 (14, 15) 以取代文献中的许多不同定义 (7, 8, 13, 16, 17)。 因此，迫切需要新的测试来诊断 TBM。

撒哈拉以南非洲地区需要即时护理 (POC) 或床边诊断工具。 TBM 的任何新测试都必须快速、易于在 POC 或床边进行，并且适合在非洲国家资源匮乏的环境中使用。 因此，此类测试最好不要使用需要专家操作的实验室仪器。 他们应该使用适合护士和社区卫生工作者使用的便携式电池或太阳能手持设备 (18)。 基于人体免疫反应的诊断可能会提供重要的补充，这些补充很容易转化为 POC 或床边诊断工具。

宿主 CSF 蛋白质特征作为 TBM 的诊断候选者。 研究人员调查了在怀疑患有 TBM 的儿童的 CSF 样本中检测到的宿主标记物作为 TBM 诊断候选者的可能性 (19)。 研究人员评估了标准 BioPlex 27plex 多重细胞因子试剂盒（Bio Rad Laboratories）中存在的宿主生物标志物的水平以及脑脊液和血清样本中的其他蛋白质生物标志物。 使用 Glucore Omics Explorer 进行的无监督层次聚类和主成分分析揭示了脑脊液中检测到的生物标志物对 TBM 患者的显着聚类。

包含血管内皮生长因子 (VEGF)、白细胞介素 (IL)-13 和抗菌肽导管素 LL-37 的 3 标记宿主蛋白生物印记显示出作为 TBM 诊断生物印记的潜力（国际专利申请：PCT/IB2015/052751 ) (19)，诊断 TBM 的接受者操作特征曲线下面积 (AUC) 为 0.91，灵敏度为 52%，但特异性良好，为 95%。 自该生物印记发表以来，研究人员评估了来自 5 个不同非洲国家（南非、纳米比亚、马拉维、乌干达和埃塞俄比亚）疑似患有活动性肺结核的成年人的血清和血浆样本中超过 70 种宿主生物标志物的诊断潜力EDCTP 资助的试验 (AE-TBC)。 研究人员确定了具有强大结核病诊断潜力的 6 和 7 标记蛋白生物印记，并获得了专利（PCT/IB2015/051435 和 PCT/IB2017/052142）（20、21）。

在最近的一项研究（南非临时专利申请；Manyelo 等人，2019 年，出版中）中，研究人员假设至少一些包含我们成人蛋白质生物印记的宿主生物标志物可能对 TBM 诊断有用。 在南非技术创新署（PI：Chegou）的资助下，研究人员前瞻性地在西开普省 Tygerberg 学术医院招募了一组疑似患有 TBM 的儿童，并确定了来自这些儿童的 CSF 样本中 66 种宿主生物标志物的浓度孩子们。 研究人员还纳入了 3 种生物标志物，这些生物标志物构成了我们之前针对 TBM 的 CSF 生物印记（VEGF、IL-13 和 cathelicidin LL-37）(19)，用于这项新研究的验证目的；共有 69 种宿主蛋白​​生物标志物。

除了 VEGF（AUC 为 0.81）之外，先前 3 标记特征中单个标记的准确性很差（IL-13 和 LL-37 的 AUC 分别为 0.58 和 0.55），但是当组合使用时确认了 3 标记模型对 TBM 和非 TBM 的区分 [AUC 为 0.67 (95% CI: 0.52-0.83)； 75% 的敏感性和 65% 的特异性]。 47 个附加标记在 TBM 组和无 TBM 组之间显示出显着差异（Mann Whitney U 检验），其中 28 个显示出很强的诊断潜力，即使作为单个标记（AUC ≥ 0.80）也是如此。 这些标志物包括干扰素 (IFN)-γ、CCL18(MIP-4)、CXCL9、CCL1、CCL5(RANTES)、IL-6、肿瘤坏死因子 (TNF)-α、髓过氧化物酶 (MPO)、基质金属蛋白酶 9 (MMP) 、MMP-8、补体 C2 (CC2)、IL-10、总纤溶酶原激活物抑制剂 1 (PAI-1)、CXCL8、IL-1β、α-2-抗胰蛋白酶 (A1AT)、CXCL10、粒细胞集落刺激因子 (G- CSF)、CC4、CC4b、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、血小板衍生生长因子 (PDGF)-AB/BB、载脂蛋白 A1 (apoA1)、甘露糖结合凝集素 (MBL)、铁蛋白、CC5a、血清淀粉样蛋白 P (SAP) 和 CC5。

使用线性判别分析 (LDA) 模型研究了这些生物标志物的组合。 包含可溶性细胞内粘附分子 (sICAM)-1、MPO、CXCL8 和 IFN-γ 的 4 标记 CSF 生物印记诊断为 TBM，AUC 为 0.97（95% CI：0.92-1.00）， 灵敏度为 87% (20/23)，特异性为 95.8% (23/24)。 在留一法交叉验证后，4 标记生物印记的灵敏度和特异性没有变化。 通过选择更好的截止值进一步优化 4 标记生物印记，导致灵敏度和特异性分别达到 96% 和 96%。

由于 VEGF 在单标记分析中表现良好 (19)，研究人员评估了包括 VEGF 在内的其他生物印记的潜在准确性。 包含 VEGF、IFN-γ 和 MPO 的 3 标记模型可以在有和没有 TBM 的儿童之间进行高精度区分。 在留一法交叉验证和最佳截止值优化中，基于 3 标记 VEGF 的签名的灵敏度和特异性分别为 92% 和 100%。

血清宿主蛋白特征作为 TBM 的诊断候选者。 在 CSF 样本中研究的所有 69 种宿主标志物也使用 Luminex 多重平台在血清样本中进行了研究。 17 种分析物 [sVCAM1、CCL2、IL-4、TNF-α、CCL4、adipsin、SAP、CC5、CFH、G-CSF、IL-10、Apo-CIII、IL-17A、PAI-1] 的中位血清水平（总计）、PDGF AB/BB、MBL 和 NCAM1] 有显着差异（p<0.05； Mann Whitney U 检验）在有和没有 TBM 的儿童之间。 当通过 ROC 曲线分析评估单个血清生物标志物的诊断潜力时，13 个标志物的 AUC ≥ 0.70 有希望。 LDA 表明，使用 3 个标记可实现 TBM 的最佳诊断。 用于诊断 TBM 的最准确的 3 标记血清生物印记 [adipsin（补体因子 D）、Ab42 和 IL-10] 诊断 TBM 的 AUC 为 0.84（95% CI：0.73-0.96）， 灵敏度为 82.6% (19/23)，特异性为 75% (18/24)。 在留一法交叉验证中，灵敏度保持在 82.6% (19/23)，而特异性下降到 70.3% (17/24)。 通过选择更好的截止值进一步优化生物印记，导致灵敏度和特异性分别提高 83% 和 83%。

基于生物传感器的诊断平台。 TBM 的最佳 CSF 和血清生物标志物将被纳入一个新的 POC 诊断平台，该平台将在 SU 工程学院开发。 研究人员开发了一种使用 ZnO 纳米线的原型压电传感器，以及一种基于电纺纳米纤维网的电阻传感元件 (22)。 该设备成功检测到大肠杆菌 (23)。 研究人员还使用这种技术来检测少量的蛋白质 LC3，这是一种自噬活性的生物标志物，并且作为最近的硕士项目的一部分，该平台能够检测 IFN-γ，这是 fg/ml 范围内的关键 TB 生物标志物，从而展示其潜在的高灵敏度。

我们将使用类似的方法开发基于多生物标志物的原型测试，能够检测血清或脑脊液中多达 4 种生物标志物，并前瞻性地评估 300 名新招募的疑似 TBM 儿童的测试（目标 3）。

总体目标 主要目标是验证先前确定的宿主血清和 CSF 生物标志物，并根据这些生物标志物开发基于生物传感器的 POC 测试以诊断 TBM。

研究人员建议确定一组相关的生物标志物，这些标志物在先前的研究中显示出潜力。 这样做是为了识别可以相互替代的生物标志物，因为从基于实验室的技术平台（如 Luminex）过渡到使用基于生物传感器的技术的 POC 测试可能会面临一些标志物丢失的问题由于技术原因或由于抗体所有权或成本问题导致某些标记不可用。 然后高度相关的标记可以替代这些标记。 研究人员将测试哪一组生物标志物在 POC 诊断测试平台上效果最好。 最后，研究人员将在一个由 300 名疑似 TBM 的研究参与者组成的新队列中前瞻性地评估原型测试，如下所述。

原型测试将基于 CSF 或血清生物标志物的最佳生物印记，具体取决于哪个表现最好。 然而，开发基于血清生物标志物的测试可能是有利的，因为 CSF 样本很难收集。 此外，基于血清生物标志物的测试可以很容易地转换为基于指尖的测试，这将更容易在资源受限的环境中实施。 作为 EDCTP2 资助的联盟 (www.screen-tb.eu) 的一部分，研究人员目前正在评估基于在血清样本中发现和验证的宿主生物标志物的成人结核病指尖筛查试验。

参考

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