Evaluering af nye biomarkør-baserede tilgange til forbedring af diagnosen af ​​tuberkuløs meningitis i barndommen (TBMBIOMARKER)

BETYDNING OG RELEVANCE FOR EDCTP2 På trods af en betydelig igangværende indsats i udviklingen af ​​værktøjer til at bekæmpe tuberkulose (TB), var sygdommen ansvarlig for cirka 1,6 millioner dødsfald, hvor 10 millioner mennesker udviklede sygdommen på verdensplan i 2017 (1). Anslået en million børn blev syge med TB i 2017 (1, 2). Otte lande i Afrika eller Asien, herunder Sydafrika, Nigeria, Indien, Kina, Indonesien, Filippinerne, Pakistan og Bangladesh, tegnede sig for to tredjedele af verdens samlede TB-byrde (1). TB-incidensen i Sydafrika steg fra 301 nye tilfælde/100.000 i 1990 til 948/100.000 i 2007 (3). TB-byrden forværres af HIV-pandemien, som er udbredt i Sydafrika og andre afrikanske lande. Tuberkuløs meningitis (TBM) er den mest alvorlige form for TB, forekommer mest i den tidlige barndom og har høj morbiditet og dødelighed på grund af den forsinkede diagnose og initiering af passende behandling (4). TBM er den mest almindelige type bakteriel meningitis i Western Cape-provinsen i Sydafrika (5).

Der er behov for nye TBM-diagnostiske tests. På trods af igangværende forskning mangler tidlige og omkostningseffektive diagnostiske værktøjer til TBM (6). Påvisning af Mycobacterium tuberculosis (Mtb) i cerebrospinalvæske (CSF) er guldstandarden for diagnosticering af TBM. Desværre er følsomheden af ​​både udstrygningsmikroskopi og kultur for TBM lav (7, 8). Afhængigt af den anvendte referencestandard er følsomheden af ​​GeneXpert-testen (Cepheid Inc, USA) for TBM ca. 50-60 % og forbedret til 72 %, når centrifugeret CSF blev brugt i en undersøgelse (9). I en nyere publiceret undersøgelse udført på HIV-positive voksne, præsterede GeneXpert imidlertid med en følsomhed på 43 % eller 45 %, sammenlignet med 43 % eller 45 % for dyrkning og 70 % eller 95 % for GeneXpert Ultra, afhængigt af hvilken af de to referencestandarder blev brugt (10). På trods af den relativt høje udrulning af GeneXpert-testen i hele Sydafrika, tilbydes testen i øjeblikket for det meste på centraliserede laboratorier. Tilgængeligheden af ​​testen i andre afrikanske lande er begrænset. Diagnosen TB er afhængig af den dårligt følsomme symptomscreening og udstrygningsmikroskopi, især på sundhedscentre på landet. Mtb-kulturfaciliteter er ofte kun tilgængelige på henvisningsniveaulaboratorier, og resultaterne kan tage op til 42 dage. Behovet for flere sundhedsbesøg fører til tab af opfølgning og forsinket diagnose, hvilket fremmer spredningen af ​​TB og fremskreden lungeskade. Især ved TBM stilles korrekt diagnose først ved indlæggelse på et videregående henvisningscenter. I rutinemæssig klinisk praksis er diagnosen for det meste baseret på en kombination af kliniske fund, flere laboratorietests på CSF, billeddiagnostiske fund og udelukkelse af almindelige differentialdiagnoser (11). De fleste af disse teknikker er utilgængelige i mange miljøer med høj byrde, men ressourcebegrænsede, i det meste af Afrika syd for Sahara. Børn, der ses på primære og sekundære sundhedsfaciliteter, har ofte flere forpassede muligheder, op til seks besøg, før den endelige diagnose af TBM stilles i et miljø med relativt gode ressourcer i Sydafrika (12). Resultater fra CSF kan være meget varierende (13). For nylig har internationale eksperter foreslået nye ensartede case-definitioner, som bør anvendes i fremtidig forskning (14, 15) for at erstatte de mange forskellige definitioner i litteraturen (7, 8, 13, 16, 17). Der er derfor et presserende behov for nye tests til diagnosticering af TBM.

Point-of-care (POC) eller bedside diagnostiske værktøjer er nødvendige i Afrika syd for Sahara. Alle nye tests for TBM skal være hurtige, nemme at udføre ved POC eller sengekanten og egnet til brug i ressourcesvage omgivelser i afrikanske lande. Sådanne tests bør derfor helst ikke bruge laboratorieinstrumenter, der kræver specialister til at operere. De bør bruge bærbare batteri- eller solcelledrevne håndholdte enheder, der er egnede til brug af sygeplejersker og sundhedspersonale (18). Diagnostik baseret på det menneskelige immunrespons kan give vigtige tilføjelser, som let konverteres til POC eller diagnostiske værktøjer ved sengekanten.

Værts-CSF-proteinsignaturer som diagnostiske kandidater for TBM. Efterforskerne undersøgte potentialet for værtsmarkører påvist i CSF-prøver fra børn, der mistænkes for at have TBM som diagnostiske kandidater for TBM (19). Forskerne evaluerede niveauerne af værtsbiomarkørerne i et standard BioPlex 27plex multiplex cytokinkit (Bio Rad Laboratories) og andre proteinbiomarkører i CSF og serumprøver. En uovervåget hierarkisk clustering og principiel komponentanalyse, ved brug af Glucore Omics explorer, afslørede signifikant clustering af patienter med TBM af biomarkørerne påvist i CSF.

En 3-markør værtsproteinbiosignatur omfattende vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), interleukin (IL)-13 og det antibakterielle peptid cathelicidin, LL-37, viste potentiale som en diagnostisk biosignatur for TBM (international patentansøgning: PCT/IB2015/052751 ) (19), diagnosticering af TBM med et areal under modtageroperatørens karakteristikkurve (AUC) på 0,91, med sensitivitet på 52 %, men med god specificitet på 95 %. Siden offentliggørelsen af ​​denne biosignatur har efterforskerne evalueret det diagnostiske potentiale af >70 værtsbiomarkører i serum- og plasmaprøver fra voksne, der mistænkes for at have aktiv lunge-TB i 5 forskellige afrikanske lande (Sydafrika, Namibia, Malawi, Uganda og Etiopien) i et EDCTP-finansieret forsøg (AE-TBC). Efterforskerne identificerede, patenterede (PCT/IB2015/051435 og PCT/IB2017/052142) og publicerede 6- og 7-markørproteinbiosignaturer med stærkt diagnostisk potentiale for TB (20, 21).

I en nyere undersøgelse (South African Provisional Patent application; Manyelo et al 2019, in press) antog efterforskerne, at i det mindste nogle af værtsbiomarkørerne, der omfatter vores voksenproteinbiosignaturer, kan være nyttige til TBM-diagnostik. Finansieret af South African Technology Innovation Agency (PI: Chegou), indskrev efterforskerne prospektivt en ny kohorte af børn mistænkt for at have TBM på Tygerberg Academic Hospital, Western Cape, og bestemte koncentrationerne af 66 værtsbiomarkører i CSF-prøver fra disse børn. Efterforskerne inkluderede også de 3 biomarkører, der omfattede vores tidligere CSF-biosignatur for TBM (VEGF, IL-13 og cathelicidin LL-37) (19) til valideringsformål i denne nye undersøgelse; i alt 69 værtsproteinbiomarkører.

Med undtagelse af VEGF (AUC på 0,81) var nøjagtigheden af ​​de individuelle markører i den tidligere 3-markør signatur ringe (AUC'er på henholdsvis 0,58 og 0,55 for IL-13 og LL-37), men når de blev brugt i kombination skelnen mellem TBM og ikke-TBM ved 3-markørmodellen blev bekræftet [AUC på 0,67 (95% CI: 0,52-0,83); sensitivitet på 75 % og specificitet på 65 %]. Syvogfyrre af de yderligere markører viste signifikante forskelle mellem TBM og ingen TBM-grupper (Mann Whitney U-test), hvoraf 28 viste et stærkt diagnostisk potentiale, selv som individuelle markører (AUC ≥ 0,80). Disse markører inkluderer interferon (IFN)-y, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, tumornekrosefaktor (TNF)-α, myeloperoxidase (MPO), matrixmetalloproteinase 9 (MMP) , MMP-8, komplement C2 (CC2), IL-10, total plasminogenaktivatorhæmmer 1 (PAI-1), CXCL8, IL-1β, alfa-2-antitrypsin(A1AT), CXCL10, granulocytkolonistimulerende faktor (G- CSF), CC4, CC4b, granulocyt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF), blodplade-afledt vækstfaktor (PDGF)-AB/BB, apolipoprotein A1 (apoA1), mannosebindende lektin (MBL), ferritin, CC5a, serum amyloid P (SAP) og CC5.

Kombinationer af disse biomarkører blev undersøgt og under anvendelse af Linear Discriminant Analysis (LDA) modeller. En 4-markør CSF-biosignatur omfattende opløseligt intracellulært adhæsionsmolekyle (sICAM)-1, MPO, CXCL8 og IFN-y diagnosticeret TBM med en AUC på 0,97 (95 % CI: 0,92-1,00), med en sensitivitet på 87 % (20/23) og specificitet på 95,8 % (23/24). Efter leave-one-out krydsvalidering var der ingen ændring i sensitiviteten og specificiteten af ​​4-markør biosignaturen. Yderligere optimering af 4-markør biosignaturen ved at vælge bedre cut-off værdier resulterede i en sensitivitet og specificitet på henholdsvis 96 % og 96 %.

Da VEGF klarede sig godt i enkeltmarkøranalyser (19), evaluerede efterforskerne den potentielle nøjagtighed af andre biosignaturer, der inkluderede VEGF. En 3-markør model omfattende VEGF, IFN-γ og MPO skelnede med høj nøjagtighed mellem børn med og uden TBM. I leave-one-out krydsvalidering og optimeringer af bedste cut-off værdier var sensitiviteten og specificiteten af ​​den 3-markør VEGF-baserede signatur henholdsvis 92 % og 100 %.

Serumværtsproteinsignaturer som diagnostiske kandidater for TBM. Alle 69 værtsmarkører undersøgt i CSF-prøver blev også undersøgt på serumprøver ved brug af Luminex multiplex-platformen. Median serumniveauer af 17 analytter [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, adipsin, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( totalt), PDGF AB/BB, MBL og NCAM1] var signifikant forskellige (p<0,05; Mann Whitney U-test) mellem børn med og uden TBM. Når det diagnostiske potentiale af individuelle serumbiomarkører blev vurderet ved ROC-kurveanalyse, havde 13 af markørerne lovende AUC ≥ 0,70. LDA viste, at optimal diagnose af TBM blev opnået ved hjælp af 3 markører. Den mest nøjagtige 3-markør serumbiosignatur til diagnosticering af TBM [adipsin (komplementfaktor D), Ab42 og IL-10] diagnosticerede TBM med en AUC på 0,84 (95 % CI: 0,73-0,96), en sensitivitet på 82,6 % (19/23) og specificitet på 75 % (18/24). I "leave-one-out" krydsvalidering forblev sensitiviteten 82,6 % (19/23) med specificiteten faldende til 70,3 % (17/24). Yderligere optimering af biosignaturen ved valg af bedre afskæringsværdier resulterede i en forbedret sensitivitet og specificitet på henholdsvis 83 % og 83 %.

Biosensor-baseret diagnostisk platform. De bedst ydende CSF- og serumbiomarkører for TBM vil blive indarbejdet i en ny POC-diagnoseplatform, der skal udvikles på Det Tekniske Fakultet, SU. Efterforskerne har udviklet en prototype piezoelektrisk sensor ved hjælp af ZnO nanotråde, samt et resistivt sensorelement baseret på et elektrospundet nanofibernet (22). Enheden detekterede med succes E. coli (23). Efterforskerne har også brugt denne teknik til at detektere små mængder af proteinet LC3, en biomarkør for autofagi-aktivitet, og som en del af et nyligt masterprojekt var platformen i stand til at detektere IFN-γ, en nøgle-TB-biomarkør i fg/ml-områder, viser dermed dens potentielle højfølsomhed.

Vi vil bruge en lignende tilgang til at udvikle en multi-biomarkør baseret prototypetest, der er i stand til at påvise op til 4 biomarkører i serum eller CSF, og prospektivt evaluere testen på 300 nyrekrutterede børn med mistanke om TBM (Mål 3).

OVERORDNET MÅL Hovedformålet er at validere tidligere identificerede værtsserum- og CSF-biomarkører og at udvikle en biosensor-baseret POC-test til diagnosticering af TBM, baseret på disse biomarkører.

Efterforskerne foreslår at identificere et panel af korrelerede biomarkører, der viste potentiale i tidligere undersøgelser. Dette vil blive gjort for at identificere biomarkører, som kan erstattes med hinanden, da overgangen fra en laboratoriebaseret teknologisk platform som Luminex til en POC-test ved hjælp af en biosensorbaseret teknologi sandsynligvis vil blive konfronteret med tabet af nogle af markørerne på grund af tekniske årsager eller på grund af manglende tilgængelighed af nogle af markørerne på grund af antistofejerskab eller omkostninger. Højt korrelerede markører kan derefter erstatte sådanne markører. Efterforskerne vil teste, hvilket sæt biomarkører, der fungerer bedst i POC-diagnosetestplatformen. Endelig vil efterforskerne evaluere prototypetesten prospektivt i en ny kohorte på 300 studiedeltagere med formodet TBM som beskrevet nedenfor.

Prototypetesten vil være baseret på den bedste biosignatur af CSF eller serum biomarkører, afhængigt af hvilken der klarer sig bedst. Det kan dog være fordelagtigt at udvikle testen baseret på serumbiomarkører, da CSF-prøver er svære at indsamle. Desuden kan en test baseret på serum biomarkører let konverteres til en fingerstik baseret test, som vil være meget nemmere at implementere i ressourcebegrænsede omgivelser. Efterforskerne evaluerer i øjeblikket en fingerstiksscreeningstest for voksen TB baseret på værtsbiomarkører opdaget og valideret i serumprøver som en del af et EDCTP2-finansieret konsortium (www.screen-tb.eu).

Referencer

1. Verdenssundhedsorganisationen. Global tuberkuloserapport 2018.
2. Verdenssundhedsorganisationen. Faktaark om tuberkulose. 2018.
3. Verdenssundhedsorganisationen. Global tuberkulosekontrol; Epidemiologi, strategi og finansiering. Verdenssundhedsorganisationens rapport 2009.
4. Schoeman J, Wait J, Burger M, van Zyl F, Fertig G, van Rensburg AJ, et al. Langtidsopfølgning af tuberkuløs meningitis i barndommen. Udviklingsmedicin og børneneurologi. 2002;44(8):522-6. https://doi.org/10.1111/j.1469-8749.2002.tb00323.x
5. Donald PR, Cotton MF, Hendricks MK, Schaaf HS, de Villiers JN, Willemse TE. Pædiatrisk meningitis i Western Cape-provinsen i Sydafrika. Tidsskrift for tropisk pædiatri. 1996;42(5):256-61. doi: 10.1093/tropej/42.5.256.
6. Thwaites GE, van Toorn R, Schoeman J. Tuberkuløs meningitis: flere spørgsmål, stadig for få svar. Lancet-neurologien. 2013;12(10):999-1010. doi: 10.1016/S1474-4422(13)70168-6
7. Hosoglu S, Geyik MF, Balik I, Aygen B, Erol S, Aygencel TG, et al. Prædiktorer for udfald hos patienter med tuberkuløs meningitis. Det internationale tidsskrift for tuberkulose og lungesygdomme: Det officielle tidsskrift for Den Internationale Union mod Tuberkulose og Lungesygdomme. 2002;6(1):64-70. PMID: 11931403
8. van Well GT, Paes BF, Terwee CB, Springer P, Roord JJ, Donald PR, et al. Tyve år med pædiatrisk tuberkuløs meningitis: en retrospektiv kohorteundersøgelse i den vestlige kappe af Sydafrika. Pædiatri. 2009;123(1):e1-8. doi: 10.1542/peds.2008-1353
9. Bahr NC, Marais S, Caws M, van Crevel R, Wilkinson RJ, Tyagi JS, et al. GeneXpert MTB/Rif til at diagnosticere tuberkuløs meningitis: Måske den første test, men ikke den sidste. Kliniske infektionssygdomme: en officiel publikation af Infectious Diseases Society of America. 2016;62(9):1133-5. doi: 10.1093/cid/ciw083
10. Bahr NC, Nuwagira E, Evans EE, Cresswell FV, Bystrom PV, Byamukama A, et al. Diagnostisk nøjagtighed af Xpert MTB/RIF Ultra til tuberkuløs meningitis hos HIV-inficerede voksne: en prospektiv kohorteundersøgelse. Lancet infektionssygdomme. 2018;18(1):68-75. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30474-7.
11. Marais SW, Wilkinson RJ. Diagnosen og medicinsk behandling af tuberkuløs meningitis hos voksne. South African Medical Journal. 2014;104(12). DOI:10.7196/SAMJ.9060
12. Solomons R, Grantham M, Marais BJ, van Toorn R. IMCI indikatorer for børns TBM på primært sundhedsniveau i Western Cape-provinsen i Sydafrika. Det internationale tidsskrift for tuberkulose og lungesygdomme: Det officielle tidsskrift for Den Internationale Union mod Tuberkulose og Lungesygdomme. 2016;20(10):1309-13. DOI: 10.5588/ijtld.16.0062
13. Bhigjee AI, Padayachee R, Paruk H, Hallwirth-Pillay KD, Marais S, Connoly C. Diagnose af tuberkuløs meningitis: kliniske og laboratorieparametre. Internationalt tidsskrift for infektionssygdomme: IJID: officiel publikation af International Society for Infectious Diseases. 2007;11(4):348-54. DOI: 10.1016/j.ijid.2006.07.007
14. Marais S, Thwaites G, Schoeman JF, Torok ME, Misra UK, Prasad K, et al. Tuberkuløs meningitis: en ensartet case definition til brug i klinisk forskning. Lancet infektionssygdomme. 2010;10(11):803-12. doi: 10.1016/S1473-3099(10)70138-9
15. Goenka A, Jeena PM, Mlisana K, Solomon T, Spicer K, Stephenson R, et al. Hurtig nøjagtig identifikation af tuberkuløs meningitis blandt sydafrikanske børn ved hjælp af et nyt klinisk beslutningsværktøj. The Pediatric Infectious Sygdom Journal. 2018;37(3):229-34. DOI: 10.1097/INF.0000000000001726
16. Andronikou S, Wilmshurst J, Hatherill M, VanToorn R. Fordeling af hjerneinfarkt hos børn med tuberkuløs meningitis og korrelation med resultatscore efter 6 måneder. Pædiatrisk radiologi. 2006;36(12):1289-94. DOI: 10.1007/s00247-006-0319-7
17. Saitoh A, Pong A, Waecker NJ, Jr., Leake JA, Nespeca MP, Bradley JS. Forudsigelse af neurologiske følgesygdomme i barndoms tuberkuløs meningitis: en gennemgang af 20 tilfælde og forslag til et nyt scoringssystem. The Pediatric Infectious Sygdom Journal. 2005;24(3):207-12. DOI: 10.1097/01.inf.0000154321.61866.2d
18. Verdenssundhedsorganisationen. Møderapport: Højprioriterede målproduktprofiler for ny tuberkulosediagnostik: rapport fra et konsensusmøde. Genève: Verdenssundhedsorganisationen; 2014 28.-29. april 2014.
19. Visser DH, Solomons RS, Ronacher K, van Well GT, Heymans MW, Walzl G, et al. Værts immunrespons på tuberkuløs meningitis. Kliniske infektionssygdomme: en officiel publikation af Infectious Diseases Society of America. 2015;60(2):177-87. doi: 10.1093/cid/ciu781
20. Chegou NN, Sutherland JS, Malherbe S, Crampin AC, Corstjens PL, Geluk A, et al. Diagnostisk ydeevne af en syv-markør serumproteinbiosignatur til diagnosticering af aktiv TB-sygdom hos deltagere i afrikanske primære sundhedsklinikker med tegn og symptomer, der tyder på TB. Thorax. 2016. Thorax. 2016;71(9):785-94. doi: 10.1136/thoraxjnl-2015-207999
21. Jacobs R, Malherbe S, Loxton AG, Stanley K, van der Spuy G, Walzl G, et al. Identifikation af nye værtsbiomarkører i plasma som kandidater til immundiagnose af tuberkulosesygdom og overvågning af tuberkulosebehandlingsrespons. Oncotarget. 2016;7(36):57581-92. doi: 10.18632/oncotarget.11420
22. Neveling DP, van den Heever TS, Perold WJ, Dicks LMT. En nanoforce ZnO nanowire-array biosensor til påvisning og kvantificering af immunglobuliner. Sensorer og aktuatorer B. 2014;203:102-10. https://doi.org/10.1016/j.snb.2014.06.076
23. Maas MB, Maybery GHC, Perold WJ, Neveling DP, Dicks LMT. Borosilikatglasfiberoptisk biosensor til påvisning af Escherichia coli. Aktuel mikrobiologi. 2018;75(2):150-5. doi: 10.1007/s00284-017-1359-y.
24. Corstjens PL, Tjon Kon Fat EM, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Franken KL, Chegou NN, et al. Multicenter-evaluering af et brugervenligt lateralt flow-assay til bestemmelse af IP-10- og CCL4-niveauer i blod fra TB- og ikke-TB-tilfælde i Afrika. Klinisk biokemi. 2016;49(1-2):22-31. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2015.08.013
25. Sutherland JS, Mendy J, Gindeh A, Walzl G, Togun T, Owolabi O, et al. Anvendelse af lateral flow-assays til at bestemme IP-10- og CCL4-niveauer i pleurale effusioner og fuldblod til TB-diagnose. Tuberkulose (Edinburgh, Skotland). 2016;96:31-6. doi: 10.1016/j.tube.2015.10.011.
26. Marais BJ, Heemskerk AD, Marais SS, van Crevel R, Rohlwink U, Caws M, et al. Standardiserede metoder til forbedret kvalitet og sammenlignelighed af undersøgelser af tuberkuløs meningitis. Kliniske infektionssygdomme: en officiel publikation af Infectious Diseases Society of America. 2017;64(4):501-9. doi: 10.1093/cid/ciw757.
27. Kashyap RS, Dobos KM, Belisle JT, Purohit HJ, Chandak NH, Taori GM, et al. Demonstration af komponenter af antigen 85-kompleks i cerebrospinalvæske hos patienter med tuberkuløs meningitis. Klinisk og diagnostisk laboratorieimmunologi. 2005;12(6):752-8. DOI: 10.1128/CDLI.12.6.752-758.2005
28. du Preez K, Seddon JA, Schaaf HS, Hesseling AC, Starke JR, Osman M, et al. Global mangel på BCG-vaccine og tuberkuløs meningitis hos børn. The Lancet Global sundhed. 2019;7(1):e28-e9. DOI:10.1016/S2214-109X(18)30474-1