소아 결핵성 수막염의 진단을 개선하기 위한 새로운 바이오마커 기반 접근법의 평가 (TBMBIOMARKER)

EDCTP2의 중요성 및 관련성 결핵(TB) 퇴치를 위한 도구 개발에 지속적으로 상당한 노력을 기울였음에도 불구하고 이 질병으로 약 160만 명이 사망했으며 2017년에는 전 세계적으로 1천만 명이 이 질병에 걸렸습니다(1). 2017년에 약 백만 명의 어린이가 결핵에 걸렸습니다(1, 2). 남아공, 나이지리아, 인도, 중국, 인도네시아, 필리핀, 파키스탄, 방글라데시 등 아프리카 또는 아시아의 8개국이 전 세계 결핵 총 부담의 3분의 2를 차지했습니다(1). 남아공의 결핵 발병률은 1990년 301건/100,000건에서 2007년 948건/100,000건으로 증가했습니다(3). 결핵 부담은 남아프리카와 다른 아프리카 국가에서 만연한 HIV 전염병으로 인해 악화됩니다. 결핵성 뇌수막염(TBM)은 결핵의 가장 심각한 형태로, 대부분 유아기에 발생하며 진단 및 적절한 치료의 지연으로 인해 이환율과 사망률이 높습니다(4). TBM은 남아프리카 서부 케이프 주에서 가장 흔한 유형의 세균성 수막염입니다(5).

새로운 TBM 진단 테스트가 필요합니다. 지속적인 연구에도 불구하고 TBM에 대한 조기 및 비용 효율적인 진단 도구가 부족합니다(6). 뇌척수액(CSF)에서 Mycobacterium tuberculosis(Mtb)의 검출은 TBM 진단을 위한 황금 표준입니다. 불행히도 TBM에 대한 스미어 현미경과 배양의 민감도는 낮습니다(7, 8). 사용된 참조 표준에 따라 TBM에 대한 GeneXpert 테스트(Cepheid Inc, USA)의 민감도는 약 50-60%이며 한 연구에서 원심분리 CSF를 사용했을 때 72%로 개선되었습니다(9). 그러나 최근에 발표된 HIV 양성 성인에 대한 연구에서 GeneXpert는 43% 또는 45%의 민감도로 수행했으며, 이는 배양의 경우 43% 또는 45%, GeneXpert Ultra의 경우 70% 또는 95%였습니다. 2개의 참조 표준이 사용되었습니다(10). 남아프리카 전역에서 GeneXpert 테스트의 상대적으로 높은 출시에도 불구하고 이 테스트는 현재 대부분 중앙 연구소에서 제공됩니다. 다른 아프리카 국가에서 테스트의 가용성은 제한적입니다. 결핵의 진단은 특히 시골 보건소에서 민감도가 낮은 증상 선별 검사와 도말 현미경 검사에 의존합니다. Mtb 배양 시설은 위탁 수준 실험실에서만 이용 가능한 경우가 많으며 결과는 최대 42일이 소요될 수 있습니다. 여러 번의 건강 관리 방문이 필요하기 때문에 후속 조치가 이루어지지 않고 진단이 지연되어 결핵 확산과 폐 손상이 진행됩니다. 특히 TBM의 경우 3차 의뢰센터에 입원해야만 정확한 진단이 내려진다. 일상적인 임상 실습에서 진단은 대부분 임상 소견, CSF에 대한 여러 실험실 검사, 영상 소견 및 일반적인 감별 진단의 배제의 조합을 기반으로 합니다(11). 이러한 기술의 대부분은 대부분의 사하라 사막 이남 아프리카에서 많은 부담이 있지만 리소스가 제한된 환경에서는 사용할 수 없습니다. 1차 및 2차 의료 시설에서 진료를 받는 어린이는 남아공의 상대적으로 자원이 풍부한 환경에서 TBM의 최종 진단이 이루어지기 전에 최대 6번의 방문으로 여러 번 기회를 놓치는 경우가 많습니다(12). CSF의 결과는 매우 가변적일 수 있습니다(13). 최근 국제 전문가들은 문헌(7, 8, 13, 16, 17)의 다양한 정의를 대체하기 위해 향후 연구(14, 15)에 채택되어야 하는 새로운 통일된 사례 정의를 제안했습니다. 따라서 TBM 진단을 위한 새로운 검사가 시급히 필요합니다.

사하라 사막 이남 아프리카에서는 현장 진료(POC) 또는 병상 진단 도구가 필요합니다. TBM에 대한 모든 새로운 테스트는 POC 또는 병상에서 빠르고 쉽게 수행할 수 있어야 하며 아프리카 국가의 자원이 부족한 환경에서 사용하기에 적합해야 합니다. 따라서 이러한 테스트는 전문가가 작동해야 하는 실험실 장비를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 그들은 간호사와 지역사회 의료 종사자가 사용하기에 적합한 휴대용 배터리 또는 태양열로 작동되는 핸드헬드 장치를 사용해야 합니다(18). 인간 면역 반응에 기반한 진단은 POC 또는 침상 진단 도구로 쉽게 변환되는 중요한 추가 기능을 제공할 수 있습니다.

TBM에 대한 진단 후보로서 호스트 CSF 단백질 서명. 연구자들은 TBM에 대한 진단 후보로서 TBM이 있는 것으로 의심되는 어린이의 CSF 샘플에서 검출된 숙주 마커의 가능성을 조사했습니다(19). 연구자들은 표준 BioPlex 27plex 멀티플렉스 사이토카인 키트(Bio Rad Laboratories)에 존재하는 숙주 바이오마커의 수준과 CSF 및 혈청 샘플의 다른 단백질 바이오마커를 평가했습니다. Glucore Omics 탐색기를 사용한 감독되지 않은 계층적 클러스터링 및 주성분 분석은 CSF에서 검출된 바이오마커에 의해 TBM 환자의 중요한 클러스터링을 나타냈습니다.

혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨(IL)-13 및 항균 펩타이드 카텔리시딘 LL-37을 포함하는 3-마커 숙주 단백질 생체특징은 TBM에 대한 진단적 생체특징으로서의 가능성을 보여주었다(국제 특허 출원: PCT/IB2015/052751). ) (19), 0.91의 수신자 조작자 특성 곡선(AUC) 아래 면적으로 TBM을 진단하고 민감도는 52%이지만 특이도는 95%로 양호합니다. 이 생체특징이 발표된 이후, 연구자들은 5개 아프리카 국가(남아프리카, 나미비아, 말라위, 우간다 및 에티오피아)에서 활동성 폐결핵이 의심되는 성인의 혈청 및 혈장 샘플에서 70개 이상의 숙주 바이오마커의 진단 가능성을 평가했습니다. EDCTP 자금 지원 시험(AE-TBC). 연구자들은 TB에 대한 강력한 진단 가능성이 있는 6- 및 7-마커 단백질 생체특징을 확인하고 특허를 받았으며(PCT/IB2015/051435 및 PCT/IB2017/052142) 발표했습니다(20, 21).

보다 최근의 연구(남아공 임시 특허 출원; Manyelo et al 2019, 언론)에서 조사관은 성인 단백질 생체특징을 구성하는 숙주 바이오마커 중 적어도 일부가 TBM 진단에 유용할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 남아프리카 기술 혁신 기관(PI: Chegou)의 자금 지원을 받은 조사관은 웨스턴 케이프의 Tygerberg Academic 병원에서 TBM이 의심되는 새로운 아동 코호트를 전향적으로 등록하고 이들의 CSF 샘플에서 66개의 숙주 바이오마커 농도를 결정했습니다. 어린이들. 연구자들은 또한 이 새로운 연구에서 검증 목적을 위해 TBM(VEGF, IL-13 및 cathelicidin LL-37)(19)에 대한 이전 CSF 생체특징을 구성하는 3개의 바이오마커를 포함했습니다. 총 69개의 숙주 단백질 바이오마커.

VEGF(AUC 0.81)를 제외하고, 이전 3-마커 서명에서 개별 마커의 정확도는 좋지 않았지만(IL-13 및 LL-37에 대해 각각 AUC 0.58 및 0.55) 조합하여 사용하면 3-마커 모델에 의한 TBM과 비-TBM의 구별이 확인되었다[AUC 0.67(95% CI: 0.52-0.83); 민감도 75% 및 특이도 65%]. 추가 마커 중 47개는 TBM 그룹과 TBM 없음 그룹(Mann Whitney U 테스트) 사이에 상당한 차이를 보였고, 28개는 개별 마커(AUC ≥ 0.80)로서도 강력한 진단 가능성을 보여주었습니다. 이러한 마커에는 인터페론(IFN)-γ, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, 종양 괴사 인자(TNF)-α, 골수페록시다제(MPO), 매트릭스 메탈로프로테이나제 9(MMP)가 포함됩니다. , MMP-8, 보체 C2(CC2), IL-10, 총 플라스미노겐 활성인자 억제제 1(PAI-1), CXCL8, IL-1β, 알파-2-항트립신(A1AT), CXCL10, 과립구 콜로니 자극 인자(G- CSF), CC4, CC4b, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)-AB/BB, 아포지단백질 A1(apoA1), 만노스 결합 렉틴(MBL), 페리틴, CC5a, 혈청 아밀로이드 P(SAP) 및 CC5.

이러한 바이오마커의 조합을 조사하고 선형 판별 분석(LDA) 모델을 사용했습니다. 가용성 세포내 부착 분자(sICAM)-1, MPO, CXCL8 및 IFN-γ를 포함하는 4-마커 CSF 생체특징은 AUC가 0.97(95% CI: 0.92-1.00)인 TBM으로 진단되었습니다. 민감도는 87%(20/23)이고 특이도는 95.8%(23/24)입니다. leave-one-out 교차 검증 후, 4-마커 생체특징의 민감도와 특이도에는 변화가 없었습니다. 더 나은 컷오프 값을 선택하여 4-마커 생체특징을 추가로 최적화하면 민감도와 특이도가 각각 96%와 96%가 되었습니다.

VEGF가 단일 마커 분석에서 잘 수행됨에 따라(19) 조사관은 VEGF를 포함하는 다른 생체특징의 잠재적 정확도를 평가했습니다. VEGF, IFN-γ 및 MPO로 구성된 3-마커 모델은 TBM이 있는 어린이와 없는 어린이를 높은 정확도로 구별했습니다. leave-one-out 교차 검증 및 최적 컷오프 값의 최적화에서 3-마커 VEGF 기반 시그니처의 민감도 및 특이도는 각각 92% 및 100%였습니다.

TBM의 진단 후보로서의 혈청 숙주 단백질 시그니처. CSF 샘플에서 조사된 69개의 모든 숙주 마커는 Luminex multiplex 플랫폼을 사용하여 혈청 샘플에서도 조사되었습니다. 17개 분석물질[sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, adipsin, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( total), PDGF AB/BB, MBL 및 NCAM1]은 유의미한 차이가 있었다(p<0.05; Mann Whitney U 테스트) TBM이 있는 어린이와 없는 어린이 사이. 개별 혈청 바이오마커의 진단 가능성을 ROC 곡선 분석으로 평가했을 때, 마커 중 13개가 유망한 AUC ≥ 0.70을 보였습니다. LDA는 3개의 마커를 사용하여 TBM의 최적 진단이 달성되었음을 입증했습니다. TBM 진단을 위한 가장 정확한 3-마커 혈청 생체특징[adipsin(complement factor D), Ab42 및 IL-10]은 AUC 0.84(95% CI: 0.73-0.96)로 TBM을 진단했으며, 82.6%(19/23)의 민감도 및 75%(18/24)의 특이도. leave-one-out 교차 검증에서 민감도는 82.6%(19/23)로 유지되었고 특이성은 70.3%(17/24)로 감소했습니다. 더 나은 컷오프 값을 선택하여 생체특징을 추가로 최적화하면 민감도와 특이도가 각각 83%와 83% 향상되었습니다.

바이오센서 기반 진단 플랫폼. TBM에 대한 최고 성능의 CSF 및 혈청 바이오마커는 SU의 공학부에서 개발될 새로운 POC 진단 플랫폼에 통합될 것입니다. 연구자들은 ZnO 나노와이어를 사용하는 프로토타입 압전 센서와 전기방사 나노섬유 메쉬를 기반으로 하는 저항 감지 요소를 개발했습니다(22). 장치가 대장균을 성공적으로 감지했습니다(23). 연구자들은 또한 이 기술을 사용하여 autophagy 활동에 대한 바이오마커인 소량의 단백질 LC3를 검출했으며 최근 마스터 프로젝트의 일부로 플랫폼은 fg/ml 범위의 핵심 TB 바이오마커인 IFN-γ를 검출할 수 있었습니다. 따라서 잠재적인 높은 감도를 보여줍니다.

유사한 접근 방식을 사용하여 혈청 또는 CSF에서 최대 4개의 바이오마커를 검출할 수 있는 다중 바이오마커 기반 프로토타입 테스트를 개발하고 TBM이 의심되는 300명의 새로 모집된 어린이에 대한 테스트를 전향적으로 평가할 것입니다(목표 3).

전반적인 목표 주요 목표는 이전에 확인된 숙주 혈청 및 CSF 바이오마커를 검증하고 이러한 바이오마커를 기반으로 TBM 진단을 위한 바이오센서 기반 POC 테스트를 개발하는 것입니다.

연구자들은 이전 연구에서 잠재력을 보인 상관관계가 있는 바이오마커 패널을 식별할 것을 제안합니다. Luminex와 같은 실험실 기반 기술 플랫폼에서 바이오 센서 기반 기술을 사용하는 POC 테스트로 전환하는 경우 일부 마커가 손실될 가능성이 있으므로 서로 대체할 수 있는 바이오 마커를 식별하기 위해 수행됩니다. 기술적 이유 또는 항체 소유권 또는 비용 문제로 인해 일부 마커를 사용할 수 없기 때문입니다. 상관관계가 높은 마커는 그런 마커를 대체할 수 있습니다. 조사관은 POC 진단 테스트 플랫폼에서 가장 잘 작동하는 바이오마커 세트를 테스트합니다. 마지막으로 조사관은 아래에 설명된 대로 TBM이 의심되는 300명의 연구 참가자로 구성된 새로운 코호트에서 프로토타입 테스트를 전향적으로 평가합니다.

프로토타입 테스트는 CSF 또는 혈청 바이오마커의 최상의 생체특징을 기반으로 하며, 어느 것이 가장 잘 수행되는지에 따라 달라집니다. 그러나 CSF 샘플을 수집하기 어렵기 때문에 혈청 바이오마커를 기반으로 테스트를 개발하는 것이 유리할 수 있습니다. 또한, 혈청 바이오마커에 기반한 테스트는 자원 제약 환경에서 구현하기 훨씬 더 쉬운 손가락 기반 테스트로 쉽게 변환될 수 있습니다. 조사관은 현재 EDCTP2 지원 컨소시엄(www.screen-tb.eu)의 일부로 혈청 샘플에서 발견되고 검증된 숙주 바이오마커를 기반으로 성인 TB에 대한 손가락 검사 검사를 평가하고 있습니다.

참조

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