Új biomarker alapú megközelítések értékelése a gyermekkori tuberkulózisos agyhártyagyulladás diagnózisának javítására (TBMBIOMARKER)

AZ EDCTP2 FONTOSSÁGA ÉS RELEvancia A tuberkulózis (TB) leküzdésére szolgáló eszközök kifejlesztésére irányuló folyamatos erőfeszítések ellenére a betegség körülbelül 1,6 millió halálesetért volt felelős, és 2017-ben 10 millió embernél alakult ki a betegség világszerte (1). Becslések szerint 2017-ben egymillió gyermek betegedett meg tbc-ben (1, 2). Nyolc afrikai vagy ázsiai ország, köztük Dél-Afrika, Nigéria, India, Kína, Indonézia, Fülöp-szigetek, Pakisztán és Banglades a világ tuberkulózis okozta teljes terhének kétharmadát tette ki (1). A tbc incidenciája Dél-Afrikában az 1990-es 301 új eset/100 000-ről 948/100 000-re emelkedett 2007-ben (3). A tbc-terheket rontja a HIV-járvány, amely Dél-Afrikában és más afrikai országokban tombol. A tuberkulózisos agyhártyagyulladás (TBM) a tuberkulózis legsúlyosabb formája, többnyire kora gyermekkorban fordul elő, és magas a morbiditása és mortalitása a késleltetett diagnózis és a megfelelő terápia megkezdése miatt (4). A TBM a bakteriális agyhártyagyulladás leggyakoribb típusa Dél-Afrika Western Cape tartományában (5).

Új TBM diagnosztikai tesztekre van szükség. A folyamatban lévő kutatás ellenére hiányoznak a korai és költséghatékony TBM diagnosztikai eszközök (6). A Mycobacterium tuberculosis (Mtb) kimutatása a cerebrospinális folyadékban (CSF) a TBM diagnosztizálásának arany standardja. Sajnos mind a kenetmikroszkópos, mind a tenyészet érzékenysége a TBM-re alacsony (7, 8). Az alkalmazott referenciastandardtól függően a GeneXpert teszt (Cepheid Inc, USA) TBM-re vonatkozó érzékenysége körülbelül 50-60%, és 72%-ra javult, ha centrifugált CSF-et használtak egy vizsgálatban (9). Egy nemrégiben publikált HIV-pozitív felnőtteken végzett vizsgálatban azonban a GeneXpert 43%-os vagy 45%-os érzékenységgel teljesített, szemben a tenyésztésnél 43%-os vagy 45%-os, a GeneXpert Ultra esetében pedig 70%-os vagy 95%-os érzékenységgel, attól függően, hogy a két referenciastandard közül (10). Annak ellenére, hogy a GeneXpert teszt viszonylag magas elterjedtsége Dél-Afrikában, a tesztet jelenleg többnyire központosított laboratóriumokban kínálják. A teszt elérhetősége más afrikai országokban korlátozott. A tbc diagnózisa a rosszul érzékeny tünetszűrésen és kenetmikroszkópián alapul, különösen a vidéki egészségügyi központokban. Az Mtb-tenyésztési létesítmények gyakran csak beutalási szintű laboratóriumokban állnak rendelkezésre, és az eredmények elérése akár 42 napot is igénybe vehet. A többszöri egészségügyi látogatás szükségessége a nyomon követés elvesztéséhez és a diagnózis késleltetéséhez vezet, elősegítve a tbc terjedését és előrehaladott tüdőkárosodást. Különösen a TBM esetében a megfelelő diagnózist csak a felsőfokú beutaló központba történő felvételkor állítják fel. A rutin klinikai gyakorlatban a diagnózis többnyire a klinikai leletek, a cerebrospinalis folyadék több laboratóriumi vizsgálatán, a képalkotó leleteken és a gyakori differenciáldiagnózisok kizárásán alapul (11). Ezeknek a technikáknak a többsége nem érhető el sok nagy teherrel járó, de erőforrás-korlátozott környezetben a legtöbb szubszaharai Afrika területén. Az elsődleges és másodlagos egészségügyi intézményekben látott gyermekeknek gyakran több elszalasztott lehetőségük van, akár hat látogatást is megtehetnek, mielőtt a tuberkulózis diagnózisát felállítják egy viszonylag jó forrásokkal rendelkező dél-afrikai környezetben (12). A CSF megállapításai nagyon változóak lehetnek (13). A közelmúltban nemzetközi szakértők új, egységes esetdefiníciókat javasoltak, amelyeket a jövőbeni kutatások során kell alkalmazni (14, 15) a szakirodalomban található sokféle definíció helyébe (7, 8, 13, 16, 17). Ezért sürgősen új tesztekre van szükség a TBM diagnózisához.

A szubszaharai Afrikában szükség van gondozási pontokra (POC) vagy ágy melletti diagnosztikai eszközökre. A TBM minden új tesztjének gyorsnak kell lennie, könnyen végrehajthatónak kell lennie a POC-ban vagy az ágy mellett, és alkalmasnak kell lennie az afrikai országok erőforrásszegény környezetében való használatra. Az ilyen vizsgálatoknál ezért lehetőleg ne használjunk olyan laboratóriumi műszereket, amelyek működéséhez szakemberekre van szükség. Hordozható akkumulátorral vagy napenergiával működő kézi eszközöket kell használniuk, amelyek alkalmasak ápolók és közösségi egészségügyi dolgozók általi használatra (18). Az emberi immunválaszon alapuló diagnosztika fontos kiegészítéseket jelenthet, amelyek könnyen átalakíthatók POC-vé vagy ágy melletti diagnosztikai eszközökké.

Gazda CSF-fehérje aláírások a TBM diagnosztikai jelöltjeiként. A kutatók megvizsgálták a TBM-re gyanús gyermekek CSF-mintáiban kimutatott gazdamarkerek potenciálját a TBM diagnosztikai jelöltjeként (19). A kutatók a standard BioPlex 27plex multiplex citokinkészletben (Bio Rad Laboratories) és más fehérje biomarkerek szintjét értékelték a CSF-ben és a szérummintákban. A felügyelet nélküli hierarchikus klaszterezés és a főkomponens-elemzés a Glucore Omics felfedező segítségével a TBM-ben szenvedő betegek jelentős csoportosítását tárta fel a CSF-ben kimutatott biomarkerek hatására.

A vaszkuláris endoteliális növekedési faktort (VEGF), az interleukin (IL)-13 és az antibakteriális katelicidin, az LL-37 antibakteriális peptidet tartalmazó 3 markeres gazdafehérje bioszignációja alkalmasnak bizonyult a TBM diagnosztikai bioszignációjaként (nemzetközi szabadalmi bejelentés: PCT/IB2015/052751). ) (19), a TBM diagnosztizálása 0,91 vevő operátori karakterisztikai görbe (AUC) alatti területtel, 52%-os érzékenységgel, de jó 95%-os specificitással. A biosignatúra közzététele óta a kutatók 5 különböző afrikai országban (Dél-Afrika, Namíbia, Malawi, Uganda és Etiópia) értékelték több mint 70 gazdabiomarker diagnosztikai potenciálját olyan felnőttek szérum- és plazmamintáiban, akiknél feltehetően aktív tüdőtbc-ben szenvednek. egy EDCTP által finanszírozott próba (AE-TBC). A kutatók azonosították, szabadalmaztatták (PCT/IB2015/051435 és PCT/IB2017/052142), és publikáltak olyan 6 és 7 markeres fehérje bioszignátumokat, amelyek erős diagnosztikai potenciállal rendelkeznek a tuberkulózisra (20, 21).

Egy újabb tanulmányban (dél-afrikai ideiglenes szabadalmi bejelentés; Manyelo et al 2019, sajtó alatt) a kutatók azt feltételezték, hogy a felnőtt fehérje biosignatúráit tartalmazó gazdabiomarkerek közül legalább néhány hasznos lehet a TBM diagnosztikában. A Dél-afrikai Technológiai Innovációs Ügynökség (PI: Chegou) által finanszírozott kutatók a Tygerberg Academic Hospital-ban (Western Cape) a TBM-gyanús gyermekek új csoportját vették fel, és meghatározták 66 gazdabiomarker koncentrációját az ezekből származó CSF-mintákban. gyermekek. A kutatók ebbe az új tanulmányba validálás céljából bevonták azt a 3 biomarkert is, amelyek a TBM-re vonatkozó korábbi CSF-biosignatúránkat tartalmazták (VEGF, IL-13 és katelicidin LL-37) (19); összesen 69 gazdafehérje biomarker.

A VEGF kivételével (AUC 0,81) az egyes markerek pontossága az előző 3 markeres aláírásban gyenge volt (az IL-13 és LL-37 AUC értéke 0,58, illetve 0,55), de kombinációban használva a a TBM és a no-TBM közötti megkülönböztetést a 3 markeres modell megerősítette [AUC 0,67 (95% CI: 0,52-0,83); 75%-os szenzitivitása és 65%-os specificitása]. A további markerek közül 47 szignifikáns különbséget mutatott a TBM és a TBM nélküli csoportok között (Mann Whitney U teszt), 28 pedig erős diagnosztikai potenciált mutatott, még egyéni markerként is (AUC ≥ 0,80). Ezek a markerek a következők: interferon (IFN)-γ, CCL18 (MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5 (RANTES), IL-6, tumor nekrózis faktor (TNF)-α, mieloperoxidáz (MPO), mátrix metalloproteináz 9 (MMP) , MMP-8, komplement C2 (CC2), IL-10, teljes plazminogén aktivátor inhibitor 1 (PAI-1), CXCL8, IL-1β, alfa-2-antitripszin (A1AT), CXCL10, granulocita kolónia stimuláló faktor (G- CSF), CC4, CC4b, granulocita-makrofág kolónia stimuláló faktor (GM-CSF), vérlemezke-eredetű növekedési faktor (PDGF)-AB/BB, apolipoprotein A1 (apoA1), mannózkötő lektin (MBL), ferritin, CC5a, szérum amiloid P (SAP) és CC5.

Ezen biomarkerek kombinációit Linear Discriminant Analysis (LDA) modellek alkalmazásával vizsgáltuk. Egy 4 markeres CSF biosignature, amely oldható intracelluláris adhéziós molekulát (sICAM)-1, MPO-t, CXCL8-at és IFN-y-t tartalmaz, diagnosztizált TBM 0,97 AUC-vel (95% CI: 0,92-1,00), 87%-os (20/23) érzékenységgel és 95,8%-os specificitással (23/24). Az egy-egy kihagyás keresztvalidációt követően nem változott a 4 markeres biosignature érzékenysége és specificitása. A 4 markeres biosignature további optimalizálása jobb cut-off értékek kiválasztásával 96%-os érzékenységet és 96%-os specificitást eredményezett.

Mivel a VEGF jól teljesített az egymarkeres elemzésekben (19), a kutatók értékelték a VEGF-et tartalmazó egyéb biosignature-ek lehetséges pontosságát. A VEGF-et, IFN-γ-t és MPO-t tartalmazó 3 markeres modell nagy pontossággal különböztette meg a TBM-ben szenvedő és anélküli gyermekeket. A kihagyásos keresztvalidációban és a legjobb cut-off értékek optimalizálása során a 3 markeres VEGF-alapú aláírás érzékenysége és specificitása 92%, illetve 100% volt.

A szérum gazdafehérje aláírások a TBM diagnosztikai jelöltjeiként. A CSF-mintákban vizsgált 69 gazdamarkert szérummintákon is megvizsgáltuk a Luminex multiplex platform segítségével. 17 analit medián szérumszintje [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, adipszin, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1 ( összesen), PDGF AB/BB, MBL és NCAM1] szignifikánsan különböztek (p<0,05; Mann Whitney U teszt) TBM-ben szenvedő és nem szenvedő gyermekek között. Amikor az egyes szérum biomarkerek diagnosztikai potenciálját ROC görbe analízissel értékelték, a markerek közül 13 ígéretes AUC ≥ 0,70 volt. Az LDA kimutatta, hogy a TBM optimális diagnózisát 3 marker segítségével sikerült elérni. A TBM [adipsin (D komplement faktor), Ab42 és IL-10] legpontosabb 3-markeres szérumbiosignatúrája a TBM-t 0,84-es AUC-val (95%-os CI: 0,73-0,96) diagnosztizálta. az érzékenység 82,6% (19/23) és a specificitás 75% (18/24). Az egy-egy kihagyás keresztvalidáció során az érzékenység 82,6% (19/23) maradt, a specificitás 70,3%-ra (17/24) csökkent. A biosignatúra további optimalizálása jobb küszöbértékek kiválasztásával 83%-kal, illetve 83%-kal javította az érzékenységet és a specificitást.

Bioszenzor alapú diagnosztikai platform. A legjobban teljesítő CSF és szérum biomarkereket a TBM-hez beépítik egy új POC diagnosztikai platformba, amelyet a SU Mérnöki Karán fejlesztenek ki. A kutatók kifejlesztettek egy prototípust piezoelektromos szenzort ZnO nanoszálak felhasználásával, valamint egy rezisztív érzékelőelemet, amely elektrofonású nanoszálas hálón alapul (22). A készülék sikeresen kimutatta az E. coli-t (23). A kutatók ezt a technikát alkalmazták az LC3 fehérje kis mennyiségének kimutatására is, amely az autofágia aktivitás biomarkere, és egy közelmúltbeli master projekt részeként a platform képes volt kimutatni az IFN-γ-t, a TB kulcsfontosságú biomarkert fg/ml tartományban. ezzel demonstrálva potenciális nagy érzékenységét.

Hasonló megközelítést fogunk alkalmazni egy több biomarker alapú prototípus teszt kifejlesztésére, amely akár 4 biomarkert is képes kimutatni a szérumban vagy a CSF-ben, és prospektívan értékeljük a tesztet 300 újonnan felvett, TBM-gyanús gyermeken (3. cél).

ÁLTALÁNOS CÉLKITŰZÉS A fő cél a korábban azonosított gazdaszérum és CSF biomarkerek validálása, valamint egy bioszenzor alapú POC teszt kidolgozása a TBM diagnosztizálására ezekre a biomarkerekre alapozva.

A kutatók azt javasolják, hogy azonosítsák a korrelált biomarkerek paneljét, amelyek potenciált mutattak a korábbi vizsgálatokban. Ennek célja az egymással helyettesíthető biomarkerek azonosítása, mivel a laboratóriumi technológiai platformról, például a Luminexről a bioszenzor alapú technológiát alkalmazó POC-tesztre való átálláskor valószínűleg néhány marker elvesztésével kell szembenézni. technikai okok, vagy egyes markerek antitesttulajdonlási vagy költségproblémák miatti elérhetetlensége miatt. Az erősen korrelált markerek ezután helyettesíthetik ezeket a markereket. A kutatók megvizsgálják, hogy a POC diagnosztikai tesztplatformon melyik biomarker-készlet működik a legjobban. Végül a vizsgálók prospektíven értékelik a prototípustesztet egy új, 300 fős, TBM-gyanús résztvevőből álló csoportban, az alábbiak szerint.

A prototípusteszt a CSF vagy a szérum biomarkerek legjobb biosignature-én alapul, attól függően, hogy melyik teljesít a legjobban. A szérum biomarkereken alapuló teszt kidolgozása azonban előnyös lehet, mivel a CSF-mintákat nehéz gyűjteni. Ezen túlmenően a szérum biomarkereken alapuló teszt könnyen átalakítható ujjbegy alapú tesztté, amely sokkal könnyebben végrehajtható korlátozott erőforrások mellett. A kutatók jelenleg egy EDCTP2 által finanszírozott konzorcium (www.screen-tb.eu) részeként szérummintákban felfedezett és validált gazdabiomarkereken alapuló ujjszúrási szűrőtesztet értékelnek felnőttkori tuberkulózisra.

Hivatkozások

1. Egészségügyi Világszervezet. Globális tuberkulózisjelentés 2018.
2. Egészségügyi Világszervezet. Tuberkulózis adatlap. 2018.
3. Egészségügyi Világszervezet. Globális tuberkulózis-ellenőrzés; Epidemiológia, stratégia és finanszírozás. Az Egészségügyi Világszervezet 2009. évi jelentése.
4. Schoeman J, Wait J, Burger M, van Zyl F, Fertig G, van Rensburg AJ és mások. Gyermekkori tuberkulózisos agyhártyagyulladás hosszú távú követése. Fejlődésgyógyászat és gyermekneurológia. 2002;44(8):522-6. https://doi.org/10.1111/j.1469-8749.2002.tb00323.x
5. Donald PR, Cotton MF, Hendricks MK, Schaaf HS, de Villiers JN, Willemse TE. Gyermekkori agyhártyagyulladás Dél-Afrika Western Cape tartományában. A trópusi gyermekgyógyászat folyóirata. 1996;42(5):256-61. doi: 10.1093/tropej/42.5.256.
6. Thwaites GE, van Toorn R, Schoeman J. Tuberkulózisos agyhártyagyulladás: több kérdés, még mindig túl kevés válasz. A Lancet Neurology. 2013;12(10):999-1010. doi: 10.1016/S1474-4422(13)70168-6
7. Hosoglu S, Geyik MF, Balik I, Aygen B, Erol S, Aygencel TG stb. A tuberkulózisos meningitisben szenvedő betegek kimenetelének előrejelzői. A tuberkulózis és tüdőbetegségek nemzetközi folyóirata: a Tuberculosis and Lung Disease Nemzetközi Uniójának hivatalos lapja. 2002;6(1):64-70. PMID: 11931403
8. van Well GT, Paes BF, Terwee CB, Springer P, Roord JJ, Donald PR és mások. Húsz éves gyermekkori tuberkulózisos meningitis: retrospektív kohorszvizsgálat Dél-Afrika nyugati fokán. Gyermekgyógyászat. 2009;123(1):e1-8. doi: 10.1542/peds.2008-1353
9. Bahr NC, Marais S, Caws M, van Crevel R, Wilkinson RJ, Tyagi JS és mások. GeneXpert MTB/Rif a tuberkulózisos agyhártyagyulladás diagnosztizálására: Talán az első teszt, de nem az utolsó. Klinikai fertőző betegségek: az Amerikai Infectious Diseases Society hivatalos kiadványa. 2016;62(9):1133-5. doi: 10.1093/cid/ciw083
10. Bahr NC, Nuwagira E, Evans EE, Cresswell FV, Bystrom PV, Byamukama A és mások. Az Xpert MTB/RIF Ultra diagnosztikai pontossága HIV-fertőzött felnőttek tuberkulózisos agyhártyagyulladására: prospektív kohorsz vizsgálat. A Lancet fertőző betegségek. 2018;18(1):68-75. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30474-7.
11. Marais SW, Wilkinson R J. A tuberkulózisos meningitis diagnózisa és orvosi kezelése felnőtteknél. Dél-afrikai Orvosi Lap. 2014;104(12). DOI:10.7196/SAMJ.9060
12. Solomons R, Grantham M, Marais BJ, van Toorn R. A gyermekkori TBM IMCI mutatói az elsődleges egészségügyi ellátás szintjén Dél-Afrika Western Cape tartományában. A tuberkulózis és tüdőbetegségek nemzetközi folyóirata: a Tuberculosis and Lung Disease Nemzetközi Uniójának hivatalos lapja. 2016;20(10):1309-13. DOI: 10.5588/ijtld.16.0062
13. Bhigjee AI, Padayachee R, Paruk H, Hallwirth-Pillay KD, Marais S, Connoly C. A tuberkulózisos meningitis diagnosztizálása: klinikai és laboratóriumi paraméterek. Nemzetközi fertőző betegségek folyóirata: IJID: az International Society for Infectious Diseases hivatalos kiadványa. 2007;11(4):348-54. DOI: 10.1016/j.ijid.2006.07.007
14. Marais S, Thwaites G, Schoeman JF, Torok ME, Misra UK, Prasad K stb. Tuberkulózisos agyhártyagyulladás: egységes esetmeghatározás a klinikai kutatásban. A Lancet fertőző betegségek. 2010;10(11):803-12. doi: 10.1016/S1473-3099(10)70138-9
15. Goenka A, Jeena PM, Mlisana K, Solomon T, Spicer K, Stephenson R és mások. A tuberkulózisos agyhártyagyulladás gyors és pontos azonosítása dél-afrikai gyermekek körében egy új klinikai döntési eszköz segítségével. A Gyermekfertőző betegségek folyóirata. 2018;37(3):229-34. DOI: 10.1097/INF.0000000000001726
16. Andronikou S, Wilmshurst J, Hatherill M, VanToorn R. Az agyinfarktus megoszlása ​​tuberkulózisos meningitisben szenvedő gyermekeknél és korreláció a 6 hónapos kimenetel pontszámával. Gyermekradiológia. 2006;36(12):1289-94. DOI: 10.1007/s00247-006-0319-7
17. Saitoh A, Pong A, Waecker NJ, Jr., Leake JA, Nespeca MP, Bradley JS. Neurológiai következmények előrejelzése gyermekkori tuberkulózisos meningitisben: 20 eset áttekintése és javaslat egy új pontozási rendszerre. A Gyermekfertőző betegségek folyóirata. 2005;24(3):207-12. DOI: 10.1097/01.inf.0000154321.61866.2d
18. Egészségügyi Világszervezet. Találkozói jelentés: Kiemelt prioritású céltermékprofilok az új tuberkulózis-diagnosztikához: konszenzusos értekezlet jelentése. Genf: Egészségügyi Világszervezet; 2014 2014. április 28-29.
19. Visser DH, Solomons RS, Ronacher K, van Well GT, Heymans MW, Walzl G és mások. A gazdaszervezet immunválasza a tuberkulózisos meningitisre. Klinikai fertőző betegségek: az Amerikai Infectious Diseases Society hivatalos kiadványa. 2015;60(2):177-87. doi: 10,1093/cid/ciu781
20. Chegou NN, Sutherland JS, Malherbe S, Crampin AC, Corstjens PL, Geluk A és mások. Hétmarkeres szérumfehérje biosignature diagnosztikai teljesítménye aktív tbc-betegség diagnosztizálására az afrikai alapellátási klinika résztvevőinél, akiknél a tuberkulózisra utaló jelek és tünetek jelentkeznek. Mellkas. 2016. Mellkas. 2016;71(9):785-94. doi: 10.1136/thoraxjnl-2015-207999
21. Jacobs R, Malherbe S, Loxton AG, Stanley K, van der Spuy G, Walzl G stb. Új gazdabiomarkerek azonosítása a plazmában, mint jelöltek a tuberkulózis betegség immundiagnosztikájában és a tuberkulózis kezelési válaszának monitorozásában. Oncotarget. 2016;7(36):57581-92. doi: 10.18632/oncotarget.11420
22. Neveling DP, van den Heever TS, Perold WJ, Dicks LMT. Nanoforce ZnO nanowire-array bioszenzor immunglobulinok kimutatására és mennyiségi meghatározására. Érzékelők és működtetők B. 2014;203:102-10. https://doi.org/10.1016/j.snb.2014.06.076
23. Maas MB, Maybery GHC, Perold WJ, Neveling DP, Dicks LMT. Boroszilikát üvegszálas bioszenzor az Escherichia coli kimutatására. Jelenlegi mikrobiológia. 2018;75(2):150-5. doi: 10.1007/s00284-017-1359-y.
24. Corstjens PL, Tjon Kon Fat EM, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Franken KL, Chegou NN stb. Egy felhasználóbarát laterális áramlási vizsgálat többközpontú értékelése az IP-10 és a CCL4 szintjének meghatározására tbc és nem tbc esetek vérében Afrikában. Klinikai biokémia. 2016;49(1-2):22-31. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2015.08.013
25. Sutherland JS, Mendy J, Gindeh A, Walzl G, Togun T, Owolabi O és mások. Oldalirányú áramlási vizsgálatok alkalmazása az IP-10 és a CCL4 szintjének meghatározására pleurális folyadékban és teljes vérben a TB diagnózisához. Tuberkulózis (Edinburgh, Skócia). 2016;96:31-6. doi: 10.1016/j.tube.2015.10.011.
26. Marais BJ, Heemskerk AD, Marais SS, van Crevel R, Rohlwink U, Caws M stb. Szabványosított módszerek a tuberkulózisos agyhártyagyulladás-vizsgálatok minőségének és összehasonlíthatóságának javítására. Klinikai fertőző betegségek: az Amerikai Infectious Diseases Society hivatalos kiadványa. 2017;64(4):501-9. doi: 10.1093/cid/ciw757.
27. Kashyap RS, Dobos KM, Belisle JT, Purohit HJ, Chandak NH, Taori GM és mások. A 85 antigén komplex komponenseinek kimutatása tuberkulózisos meningitises betegek agy-gerincvelői folyadékában. Klinikai és diagnosztikai laboratóriumi immunológia. 2005;12(6):752-8. DOI: 10.1128/CDLI.12.6.752-758.2005
28. du Preez K, Seddon JA, Schaaf HS, Hesseling AC, Starke JR, Osman M stb. A BCG vakcina globális hiánya és a tuberkulózisos agyhártyagyulladás gyermekeknél. A Lancet Globális egészségügy. 2019;7(1):e28-e9. DOI:10.1016/S2214-109X(18)30474-1