Bewertung neuer biomarkerbasierter Ansätze zur Verbesserung der Diagnose von tuberkulöser Meningitis im Kindesalter (TBMBIOMARKER)

BEDEUTUNG UND RELEVANZ FÜR EDCTP2 Trotz erheblicher anhaltender Anstrengungen bei der Entwicklung von Instrumenten zur Bekämpfung von Tuberkulose (TB) war die Krankheit für etwa 1,6 Millionen Todesfälle verantwortlich, wobei 10 Millionen Menschen weltweit im Jahr 2017 an der Krankheit erkrankten (1). Schätzungsweise eine Million Kinder erkrankten 2017 an Tuberkulose (1, 2). Acht Länder in Afrika oder Asien, darunter Südafrika, Nigeria, Indien, China, Indonesien, die Philippinen, Pakistan und Bangladesch, sind für zwei Drittel der weltweiten Gesamtbelastung durch TB verantwortlich (1). Die TB-Inzidenz in Südafrika stieg von 301 Neuerkrankungen/100.000 im Jahr 1990 auf 948/100.000 im Jahr 2007 (3). Die TB-Belastung wird durch die HIV-Pandemie verschlimmert, die in Südafrika und anderen afrikanischen Ländern grassiert. Tuberkulöse Meningitis (TBM) ist die schwerste Form der TB, tritt meist in der frühen Kindheit auf und hat aufgrund der verzögerten Diagnose und Einleitung einer geeigneten Therapie eine hohe Morbidität und Mortalität (4). TBM ist die häufigste Form der bakteriellen Meningitis in der Provinz Westkap in Südafrika (5).

Neue TBM-Diagnosetests sind erforderlich. Trotz laufender Forschung fehlt es an frühen und kostengünstigen Diagnosewerkzeugen für TBM (6). Der Nachweis von Mycobacterium tuberculosis (Mtb) im Liquor cerebrospinalis (CSF) ist der Goldstandard für die Diagnose von TBM. Leider ist die Sensitivität sowohl der Abstrichmikroskopie als auch der Kultur für TBM gering (7, 8). Je nach verwendetem Referenzstandard beträgt die Sensitivität des GeneXpert-Tests (Cepheid Inc, USA) für TBM etwa 50–60 % und verbesserte sich auf 72 %, wenn in einer Studie zentrifugierter Liquor verwendet wurde (9). In einer kürzlich veröffentlichten Studie, die an HIV-positiven Erwachsenen durchgeführt wurde, erzielte der GeneXpert jedoch eine Sensitivität von 43 % oder 45 %, verglichen mit 43 % oder 45 % für die Kultur und 70 % oder 95 % für den GeneXpert Ultra, je nachdem, welche der beiden Referenzstandards wurden verwendet (10). Trotz der relativ hohen Verbreitung des GeneXpert-Tests in ganz Südafrika wird der Test derzeit hauptsächlich in zentralisierten Labors angeboten. Die Verfügbarkeit des Tests in anderen afrikanischen Ländern ist begrenzt. Die Diagnose von TB stützt sich auf das wenig empfindliche Symptom-Screening und die Abstrichmikroskopie, insbesondere in ländlichen Gesundheitszentren. MTB-Kulturanlagen sind oft nur in Überweisungslabors verfügbar und die Ergebnisse können bis zu 42 Tage dauern. Die Notwendigkeit mehrerer Arztbesuche führt zu einem Verlust der Nachsorge und einer verzögerten Diagnose, was die Ausbreitung von TB und fortgeschrittene Lungenschäden fördert. Insbesondere bei TBM wird die richtige Diagnose erst bei der Aufnahme in ein Überweisungszentrum der Tertiärstufe gestellt. Im klinischen Alltag basiert die Diagnose meist auf einer Kombination aus klinischen Befunden, multiplen Laboruntersuchungen des Liquors, bildgebenden Befunden und dem Ausschluss gängiger Differenzialdiagnosen (11). Die meisten dieser Techniken sind in vielen Gebieten mit hoher Belastung, aber begrenzten Ressourcen in den meisten Teilen Afrikas südlich der Sahara nicht verfügbar. Kinder, die in Einrichtungen der primären und sekundären Gesundheitsversorgung gesehen werden, haben oft mehrere verpasste Gelegenheiten, bis zu sechs Besuche, bevor die endgültige Diagnose von TBM in einem relativ gut ausgestatteten Umfeld in Südafrika gestellt wird (12). Die Befunde aus dem Liquor können sehr unterschiedlich sein (13). Kürzlich haben internationale Experten neue einheitliche Falldefinitionen vorgeschlagen, die in der zukünftigen Forschung verwendet werden sollten (14, 15), um die vielen unterschiedlichen Definitionen in der Literatur zu ersetzen (7, 8, 13, 16, 17). Neue Tests zur Diagnose von TBM werden daher dringend benötigt.

In Subsahara-Afrika werden Point-of-Care (POC)- oder Bedside-Diagnosewerkzeuge benötigt. Alle neuen Tests für TBM müssen schnell, einfach am POC oder am Krankenbett durchzuführen und für den Einsatz in ressourcenarmen Umgebungen in afrikanischen Ländern geeignet sein. Solche Tests sollten daher vorzugsweise keine Laborgeräte verwenden, für deren Bedienung Spezialisten erforderlich sind. Sie sollten tragbare batterie- oder solarbetriebene Handgeräte verwenden, die für die Verwendung durch Krankenschwestern und kommunale Gesundheitshelfer geeignet sind (18). Eine auf der menschlichen Immunantwort basierende Diagnostik kann wichtige Ergänzungen darstellen, die leicht auf POC- oder Bedside-Diagnosewerkzeuge umgestellt werden können.

Host-CSF-Proteinsignaturen als diagnostische Kandidaten für TBM. Die Forscher untersuchten das Potenzial von Wirtsmarkern, die in Liquorproben von Kindern mit TBM-Verdacht als diagnostische Kandidaten für TBM nachgewiesen wurden (19). Die Forscher bewerteten die Konzentrationen der Wirtsbiomarker, die in einem standardmäßigen BioPlex 27plex Multiplex-Zytokin-Kit (Bio Rad Laboratories) und anderen Protein-Biomarkern in Liquor- und Serumproben vorhanden sind. Eine unüberwachte hierarchische Clusterbildung und Hauptkomponentenanalyse unter Verwendung des Glucore Omics Explorers ergab eine signifikante Häufung von Patienten mit TBM durch die im Liquor nachgewiesenen Biomarker.

Eine 3-Marker-Wirtsprotein-Biosignatur, bestehend aus vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF), Interleukin (IL)-13 und dem antibakteriellen Peptid Cathelicidin, LL-37, zeigte Potenzial als diagnostische Biosignatur für TBM (internationale Patentanmeldung: PCT/IB2015/052751 ) (19) zur Diagnose von TBM mit einer Fläche unter der Receiver Operator Characteristic Curve (AUC) von 0,91, mit einer Sensitivität von 52 %, aber mit einer guten Spezifität von 95 %. Seit der Veröffentlichung dieser Biosignatur haben die Forscher das diagnostische Potenzial von >70 Wirtsbiomarkern in Serum- und Plasmaproben von Erwachsenen mit Verdacht auf aktive Lungentuberkulose in 5 verschiedenen afrikanischen Ländern (Südafrika, Namibia, Malawi, Uganda und Äthiopien) bewertet eine EDCTP-finanzierte Studie (AE-TBC). Die Forscher identifizierten, patentierten (PCT/IB2015/051435 und PCT/IB2017/052142) und veröffentlichten Biosignaturen von 6- und 7-Markerproteinen mit starkem diagnostischem Potenzial für TB (20, 21).

In einer neueren Studie (südafrikanische vorläufige Patentanmeldung; Manyelo et al. 2019, im Druck) stellten die Forscher die Hypothese auf, dass zumindest einige der Wirtsbiomarker, die unsere adulten Protein-Biosignaturen umfassen, für die TBM-Diagnostik nützlich sein könnten. Gefördert von der South African Technology Innovation Agency (PI: Chegou) schrieben die Forscher prospektiv eine neue Kohorte von Kindern mit TBM-Verdacht am Tygerberg Academic Hospital, Western Cape, ein und bestimmten die Konzentrationen von 66 Biomarkern des Wirts in Liquorproben von diesen Kinder. Die Forscher schlossen auch die 3 Biomarker, die unsere frühere CSF-Biosignatur für TBM (VEGF, IL-13 und Cathelicidin LL-37) (19) zu Validierungszwecken in diese neue Studie einschlossen; insgesamt 69 Wirtsprotein-Biomarker.

Mit Ausnahme von VEGF (AUC von 0,81) war die Genauigkeit der einzelnen Marker in der vorherigen 3-Marker-Signatur schlecht (AUCs von 0,58 bzw. 0,55 für IL-13 und LL-37), aber wenn sie in Kombination verwendet wurden die Unterscheidung zwischen TBM und Nicht-TBM durch das 3-Marker-Modell wurde bestätigt [AUC von 0,67 (95 % KI: 0,52–0,83); Sensitivität von 75 % und Spezifität von 65 %]. Siebenundvierzig der zusätzlichen Marker zeigten signifikante Unterschiede zwischen der TBM- und der Nicht-TBM-Gruppe (Mann-Whitney-U-Test), wobei 28 sogar als Einzelmarker ein starkes diagnostisches Potenzial zeigten (AUC ≥ 0,80). Zu diesen Markern gehören Interferon (IFN)-γ, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Myeloperoxidase (MPO), Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP) , MMP-8, Komplement C2 (CC2), IL-10, Gesamt-Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1), CXCL8, IL-1β, Alpha-2-Antitrypsin (A1AT), CXCL10, Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G- CSF), CC4, CC4b, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF)-AB/BB, Apolipoprotein A1 (apoA1), Mannose-bindendes Lektin (MBL), Ferritin, CC5a, Serumamyloid P (SAP) und CC5.

Kombinationen dieser Biomarker wurden unter Verwendung von Modellen der linearen Diskriminanzanalyse (LDA) untersucht. Eine 4-Marker-CSF-Biosignatur, die lösliches intrazelluläres Adhäsionsmolekül (sICAM)-1, MPO, CXCL8 und IFN-γ umfasst, diagnostizierte TBM mit einer AUC von 0,97 (95 % KI: 0,92–1,00), mit einer Sensitivität von 87 % (20/23) und einer Spezifität von 95,8 % (23/24). Nach der Leave-One-Out-Kreuzvalidierung gab es keine Änderung der Sensitivität und Spezifität der 4-Marker-Biosignatur. Eine weitere Optimierung der 4-Marker-Biosignatur durch die Auswahl besserer Cut-off-Werte führte zu einer Sensitivität und Spezifität von 96 % bzw. 96 %.

Da VEGF in Einzelmarkeranalysen (19) gut abschneidet, bewerteten die Forscher die potenzielle Genauigkeit anderer Biosignaturen, die VEGF enthielten. Ein 3-Marker-Modell bestehend aus VEGF, IFN-γ und MPO diskriminierte mit hoher Genauigkeit zwischen den Kindern mit und ohne TBM. Bei der Leave-One-Out-Kreuzvalidierung und der Optimierung der besten Cut-off-Werte betrugen die Sensitivität und Spezifität der 3-Marker-VEGF-basierten Signatur 92 % bzw. 100 %.

Serum-Wirtsprotein-Signaturen als diagnostische Kandidaten für TBM. Alle 69 in Liquorproben untersuchten Wirtsmarker wurden auch an Serumproben unter Verwendung der Luminex-Multiplex-Plattform untersucht. Die mittleren Serumspiegel von 17 Analyten [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, Adipsin, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( total), PDGF AB/BB, MBL und NCAM1] waren signifikant unterschiedlich (p < 0,05; Mann-Whitney-U-Test) zwischen Kindern mit und ohne TBM. Als das diagnostische Potenzial einzelner Serum-Biomarker durch ROC-Kurvenanalyse bewertet wurde, hatten 13 der Marker vielversprechende AUC ≥ 0,70. LDA zeigte, dass eine optimale Diagnose von TBM unter Verwendung von 3 Markern erreicht wurde. Die genaueste 3-Marker-Serum-Biosignatur für die Diagnose von TBM [Adipsin (Komplementfaktor D), Ab42 und IL-10] diagnostizierte TBM mit einer AUC von 0,84 (95 % KI: 0,73-0,96), eine Sensitivität von 82,6 % (19/23) und eine Spezifität von 75 % (18/24). Bei der Leave-one-out-Kreuzvalidierung blieb die Sensitivität bei 82,6 % (19/23), wobei die Spezifität auf 70,3 % (17/24) abnahm. Eine weitere Optimierung der Biosignatur durch Auswahl besserer Cut-Off-Werte führte zu einer verbesserten Sensitivität und Spezifität von 83 % bzw. 83 %.

Biosensorbasierte Diagnoseplattform. Die leistungsstärksten CSF- und Serum-Biomarker für TBM werden in eine neuartige POC-Diagnoseplattform integriert, die an der Fakultät für Ingenieurwissenschaften, SU, entwickelt werden soll. Die Forscher haben einen Prototyp eines piezoelektrischen Sensors entwickelt, der ZnO-Nanodrähte verwendet, sowie ein resistives Sensorelement, das auf einem elektrogesponnenen Nanofasernetz basiert (22). Das Gerät erkannte erfolgreich E. coli (23). Die Forscher haben diese Technik auch verwendet, um kleine Mengen des Proteins LC3, eines Biomarkers für Autophagie-Aktivität, nachzuweisen, und im Rahmen eines kürzlich durchgeführten Masterprojekts war die Plattform in der Lage, IFN-γ, einen wichtigen TB-Biomarker, im fg/ml-Bereich nachzuweisen. und demonstriert damit seine potenziell hohe Empfindlichkeit.

Wir werden einen ähnlichen Ansatz verwenden, um einen Multi-Biomarker-basierten Prototyp-Test zu entwickeln, der in der Lage ist, bis zu 4 Biomarker im Serum oder Liquor nachzuweisen, und den Test prospektiv an 300 neu rekrutierten Kindern mit Verdacht auf TBM evaluieren (Ziel 3).

GESAMTZIEL Das Hauptziel ist die Validierung zuvor identifizierter Wirtsserum- und CSF-Biomarker und die Entwicklung eines biosensorbasierten POC-Tests für die Diagnose von TBM, basierend auf diesen Biomarkern.

Die Forscher schlagen vor, ein Panel korrelierter Biomarker zu identifizieren, die in früheren Studien Potenzial gezeigt haben. Dies wird getan, um Biomarker zu identifizieren, die gegeneinander ausgetauscht werden können, da der Übergang von einer laborbasierten technologischen Plattform wie Luminex zu einem POC-Test mit einer biosensorbasierten Technologie wahrscheinlich mit dem Verlust einiger der Marker konfrontiert sein wird aus technischen Gründen oder aufgrund der Nichtverfügbarkeit einiger Marker aufgrund von Antikörperbesitz oder Kostenproblemen. Hoch korrelierte Marker können dann solche Marker ersetzen. Die Ermittler werden testen, welcher Satz von Biomarkern in der POC-Diagnosetestplattform am besten funktioniert. Abschließend werden die Forscher den Prototypentest prospektiv in einer neuen Kohorte von 300 Studienteilnehmern mit Verdacht auf TBM wie unten beschrieben auswerten.

Der Prototyp-Test basiert auf der besten Biosignatur von Liquor- oder Serum-Biomarkern, je nachdem, welche am besten abschneidet. Die Entwicklung des Tests auf der Grundlage von Serum-Biomarkern kann jedoch vorteilhaft sein, da Liquorproben schwer zu sammeln sind. Darüber hinaus kann ein auf Serum-Biomarkern basierender Test leicht in einen auf Fingerstichen basierenden Test umgewandelt werden, der in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen viel einfacher zu implementieren ist. Die Forscher evaluieren derzeit einen Fingerabdruck-Screening-Test für Tuberkulose bei Erwachsenen, der auf Wirts-Biomarkern basiert, die im Rahmen eines EDCTP2-finanzierten Konsortiums (www.screen-tb.eu) in Serumproben entdeckt und validiert wurden.

Verweise

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