Hodnocení nových biomarkerových přístupů pro zlepšení diagnostiky dětské tuberkulózní meningitidy (TBMBIOMARKER)

VÝZNAM A VÝZNAM PRO EDCTP2 Navzdory značnému pokračujícímu úsilí ve vývoji nástrojů pro boj s tuberkulózou (TBC) byla tato nemoc zodpovědná za přibližně 1,6 milionu úmrtí, přičemž v roce 2017 onemocnělo celosvětově u 10 milionů lidí (1). Odhaduje se, že v roce 2017 onemocnělo TBC milion dětí (1, 2). Osm zemí v Africe nebo Asii, včetně Jižní Afriky, Nigérie, Indie, Číny, Indonésie, Filipín, Pákistánu a Bangladéše, představuje dvě třetiny celkové světové zátěže TBC (1). Výskyt TBC v Jižní Africe vzrostl z 301 nových případů/100 000 v roce 1990 na 948/100 000 v roce 2007 (3). Zátěž TBC zhoršuje pandemie HIV, která bují v Jižní Africe a dalších afrických zemích. Tuberkulózní meningitida (TBM) je nejzávažnější formou TBC, vyskytuje se většinou v raném dětství a má vysokou morbiditu a mortalitu v důsledku opožděné diagnózy a zahájení vhodné terapie (4). TBM je nejběžnějším typem bakteriální meningitidy v provincii Western Cape v Jižní Africe (5).

Jsou zapotřebí nové diagnostické testy TBM. Navzdory probíhajícímu výzkumu chybí včasné a nákladově efektivní diagnostické nástroje pro TBM (6). Detekce Mycobacterium tuberculosis (Mtb) v mozkomíšním moku (CSF) je zlatým standardem pro diagnostiku TBM. Bohužel citlivost jak mikroskopie stěru, tak kultivace pro TBM je nízká (7, 8). V závislosti na použitém referenčním standardu je citlivost testu GeneXpert (Cepheid Inc, USA) pro TBM přibližně 50–60 % a zlepšená na 72 %, když byl v jedné studii použit centrifugovaný CSF (9). V nedávno publikované studii provedené na HIV pozitivních dospělých však GeneXpert fungoval s citlivostí 43 % nebo 45 % ve srovnání se 43 % nebo 45 % pro kultivaci a 70 % nebo 95 % pro GeneXpert Ultra, v závislosti na tom, která ze dvou referenčních standardů (10). Navzdory relativně vysokému zavádění testu GeneXpert v Jižní Africe je tento test v současnosti většinou nabízen v centralizovaných laboratořích. Dostupnost testu v ostatních afrických zemích je omezená. Diagnóza TBC se opírá o málo citlivý screening symptomů a mikroskopii stěru, zejména ve venkovských zdravotních střediscích. Mtb kultivační zařízení jsou často dostupná pouze v laboratořích na úrovni doporučení a výsledky mohou trvat až 42 dní. Potřeba více návštěv zdravotní péče vede ke ztrátě sledování a opožděné diagnóze, což podporuje šíření TBC a pokročilé poškození plic. Zejména v případě TBM je správná diagnóza stanovena až po přijetí do referenčního centra na terciární úrovni. V běžné klinické praxi je diagnostika většinou založena na kombinaci klinických nálezů, vícečetných laboratorních vyšetření likvoru, zobrazovacích nálezů a vyloučení běžných diferenciálních diagnóz (11). Většina z těchto technik je nedostupná v mnoha prostředích s vysokou zátěží, ale omezenými zdroji ve většině subsaharské Afriky. Děti navštěvované v primárních a sekundárních zdravotnických zařízeních mají často mnoho promarněných příležitostí, až šest návštěv, než je případná diagnóza TBM provedena v relativně dobře vybaveném prostředí v Jižní Africe (12). Nálezy z CSF mohou být velmi variabilní (13). Nedávno mezinárodní odborníci navrhli nové jednotné definice případů, které by měly být použity v budoucím výzkumu (14, 15), aby nahradily mnoho různých definic v literatuře (7, 8, 13, 16, 17). Pro diagnostiku TBM jsou proto naléhavě zapotřebí nové testy.

V subsaharské Africe jsou zapotřebí diagnostické nástroje Point-of-care (POC) nebo u lůžka. Jakékoli nové testy na TBM musí být rychlé, snadno proveditelné na POC nebo u lůžka a vhodné pro použití v prostředí s nedostatkem zdrojů v afrických zemích. Tyto testy by proto pokud možno neměly používat laboratorní přístroje, které vyžadují obsluhu specialistů. Měli by používat přenosná ruční zařízení na baterie nebo solární energii vhodná pro použití sestrami a komunitními zdravotnickými pracovníky (18). Diagnostika založená na lidské imunitní odpovědi může poskytnout důležité doplňky, které lze snadno převést na POC nebo diagnostické nástroje u lůžka.

Hostitelské proteinové signatury CSF jako diagnostické kandidáty pro TBM. Vyšetřovatelé zkoumali potenciál hostitelských markerů detekovaných ve vzorcích CSF od dětí s podezřením na TBM jako diagnostických kandidátů na TBM (19). Vyšetřovatelé hodnotili hladiny biomarkerů hostitele přítomných ve standardní soupravě pro multiplexní cytokiny BioPlex 27plex (Bio Rad Laboratories) a dalších proteinových biomarkerů ve vzorcích CSF a séra. Nekontrolované hierarchické shlukování a analýza hlavních složek pomocí průzkumníka Glucore Omics odhalily významné shlukování pacientů s TBM pomocí biomarkerů detekovaných v CSF.

Biosignatura 3-markerového hostitelského proteinu obsahující vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), interleukin (IL)-13 a antibakteriální peptid cathelicidin, LL-37, ukázala potenciál jako diagnostický biologický podpis pro TBM (mezinárodní patentová přihláška: PCT/IB2015/052751 ) (19), diagnostikovali TBM s plochou pod křivkou charakteristiky operátora přijímače (AUC) 0,91, s citlivostí 52 %, ale s dobrou specificitou 95 %. Od zveřejnění tohoto biologického podpisu vyšetřovatelé vyhodnotili diagnostický potenciál > 70 hostitelských biomarkerů ve vzorcích séra a plazmy dospělých s podezřením na aktivní plicní TBC v 5 různých afrických zemích (Jižní Afrika, Namibie, Malawi, Uganda a Etiopie). studie financovaná EDCTP (AE-TBC). Vyšetřovatelé identifikovali, patentovali (PCT/IB2015/051435 a PCT/IB2017/052142) a publikovali 6- a 7-markerové proteinové biosignatury se silným diagnostickým potenciálem pro TBC (20, 21).

V novější studii (Jihoafrická provizorní patentová přihláška; Manyelo et al 2019, v tisku) vědci předpokládali, že alespoň některé z hostitelských biomarkerů obsahujících biosignatury našich dospělých proteinů mohou být užitečné pro diagnostiku TBM. Vyšetřovatelé financovaní Jihoafrickou agenturou pro technologické inovace (PI: Chegou) prospektivně zapsali novou kohortu dětí s podezřením na TBM v Tygerbergské akademické nemocnici ve Western Cape a určili koncentrace 66 hostitelských biomarkerů ve vzorcích CSF z těchto děti. Výzkumníci také zahrnuli 3 biomarkery, které zahrnovaly naši předchozí biosignaturu CSF pro TBM (VEGF, IL-13 a cathelicidin LL-37) (19) pro účely ověření v této nové studii; celkem 69 biomarkerů hostitelského proteinu.

S výjimkou VEGF (AUC 0,81) byla přesnost jednotlivých markerů v předchozím podpisu 3 markerů špatná (AUC 0,58 a 0,55, v tomto pořadí, pro IL-13 a LL-37), ale při použití v kombinaci byla potvrzena diskriminace mezi TBM a no-TBM pomocí 3-markerového modelu [AUC 0,67 (95% CI: 0,52-0,83); senzitivita 75 % a specificita 65 %]. Čtyřicet sedm z dalších markerů vykazovalo významné rozdíly mezi skupinami s TBM a bez TBM (Mann Whitney U test), přičemž 28 vykazovalo silný diagnostický potenciál, dokonce i jako jednotlivé markery (AUC ≥ 0,80). Mezi tyto markery patří interferon (IFN)-γ, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, tumor nekrotizující faktor (TNF)-α, myeloperoxidáza (MPO), matrix metaloproteináza 9 (MMP) , MMP-8, komplement C2 (CC2), IL-10, celkový inhibitor aktivátoru plazminogenu 1 (PAI-1), CXCL8, IL-1β, alfa-2-antitrypsin (A1AT), CXCL10, faktor stimulující kolonie granulocytů (G- CSF), CC4, CC4b, faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), růstový faktor odvozený od destiček (PDGF)-AB/BB, apolipoprotein A1 (apoA1), lektin vázající manózu (MBL), feritin, CC5a, sérový amyloid P (SAP) a CC5.

Kombinace těchto biomarkerů byly zkoumány pomocí modelů lineární diskriminační analýzy (LDA). Biosignatura 4-markerového CSF ​​obsahující rozpustnou intracelulární adhezní molekulu (sICAM)-1, MPO, CXCL8 a IFN-γ diagnostikovanou TBM s AUC 0,97 (95% CI: 0,92-1,00), se senzitivitou 87 % (20/23) a specificitou 95,8 % (23/24). Po vynechání křížové validace nedošlo k žádné změně v senzitivitě a specificitě biosignatury 4 markerů. Další optimalizace biosignatury 4 markerů výběrem lepších hraničních hodnot vedla k senzitivitě a specificitě 96 %, respektive 96 %.

Protože VEGF fungoval dobře v analýzách jednoho markeru (19), vyšetřovatelé hodnotili potenciální přesnost dalších biologických signatur, které zahrnovaly VEGF. 3-markerový model obsahující VEGF, IFN-γ a MPO rozlišoval s vysokou přesností mezi dětmi s a bez TBM. Při vynechání křížové validace a optimalizací nejlepších hraničních hodnot byla senzitivita a specificita 3-markerového podpisu založeného na VEGF 92 % a 100 %.

Signatury sérového hostitelského proteinu jako diagnostických kandidátů pro TBM. Všech 69 hostitelských markerů vyšetřovaných ve vzorcích CSF bylo také vyšetřováno na vzorcích séra pomocí multiplexní platformy Luminex. Střední sérové ​​hladiny 17 analytů [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, adipsin, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( celkové), PDGF AB/BB, MBL a NCAM1] byly významně odlišné (p<0,05; Mann Whitney U test) mezi dětmi s a bez TBM. Když byl diagnostický potenciál jednotlivých sérových biomarkerů hodnocen analýzou ROC křivky, 13 z markerů mělo slibnou AUC ≥ 0,70. LDA prokázala, že optimální diagnózy TBM bylo dosaženo pomocí 3 markerů. Nejpřesnější 3-markerový sérový biologický podpis pro diagnózu TBM [adipsin (komplementový faktor D), Ab42 a IL-10] diagnostikoval TBM s AUC 0,84 (95% CI: 0,73-0,96), senzitivita 82,6 % (19/23) a specificita 75 % (18/24). Při vynechání křížové validace zůstala senzitivita 82,6 % (19/23) se specificitou klesající na 70,3 % (17/24). Další optimalizace biosignatury výběrem lepších hraničních hodnot vedla ke zlepšení senzitivity a specificity o 83 % a 83 %.

Diagnostická platforma založená na biosenzorech. Nejvýkonnější CSF a sérové ​​biomarkery pro TBM budou začleněny do nové diagnostické platformy POC, která bude vyvinuta na Technické fakultě SU. Vyšetřovatelé vyvinuli prototyp piezoelektrického senzoru využívajícího nanodrátky ZnO a také odporový snímací prvek založený na elektrospřádaném nanovlákenném pletivu (22). Přístroj úspěšně detekoval E. coli (23). Výzkumníci také použili tuto techniku ​​k detekci malých množství proteinu LC3, biomarkeru pro autofagickou aktivitu, a jako součást nedávného hlavního projektu byla platforma schopna detekovat IFN-γ, klíčový biomarker TB v rozmezí fg/ml, což demonstruje jeho potenciálně vysokou citlivost.

Podobný přístup použijeme k vývoji prototypového testu založeného na multi-biomarkerech, který je schopen detekovat až 4 biomarkery v séru nebo CSF, a prospektivně vyhodnotíme test na 300 nově přijatých dětech s podezřením na TBM (cíl 3).

CELKOVÝ CÍL Hlavním cílem je ověřit dříve identifikované biomarkery hostitelského séra a CSF a vyvinout POC test založený na biosenzorech pro diagnostiku TBM, založený na těchto biomarkerech.

Výzkumníci navrhují identifikovat panel korelovaných biomarkerů, které ukázaly potenciál v předchozích studiích. To bude provedeno za účelem identifikace biomarkerů, které lze vzájemně nahradit, protože přechod z laboratorní technologické platformy, jako je Luminex, k testu POC využívajícím technologii založenou na biosenzorech, bude pravděpodobně čelit ztrátě některých markerů. z technických důvodů nebo z důvodu nedostupnosti některých markerů z důvodu vlastnictví protilátek nebo nákladů. Vysoce korelované markery pak mohou takové markery nahradit. Vyšetřovatelé otestují, která sada biomarkerů funguje nejlépe na diagnostické testovací platformě POC. Nakonec vyšetřovatelé vyhodnotí prototypový test prospektivně v nové kohortě 300 účastníků studie s podezřením na TBM, jak je popsáno níže.

Test prototypu bude založen na nejlepším biologickém podpisu CSF nebo biomarkerů séra, v závislosti na tom, který funguje nejlépe. Vyvinutí testu založeného na sérových biomarkerech však může být výhodné, protože vzorky CSF se obtížně sbírají. Kromě toho lze test založený na sérových biomarkerech snadno převést na test založený na píchnutí prstu, který bude mnohem snazší implementovat v prostředí s omezenými zdroji. Vyšetřovatelé v současné době vyhodnocují screeningový test z prstu na tuberkulózu dospělých na základě hostitelských biomarkerů objevených a validovaných ve vzorcích séra v rámci konsorcia financovaného EDCTP2 (www.screen-tb.eu).

Reference

1. Světová zdravotnická organizace. Globální zpráva o tuberkulóze za rok 2018.
2. Světová zdravotnická organizace. Informační list o tuberkulóze. 2018.
3. Světová zdravotnická organizace. globální kontrola tuberkulózy; Epidemiologie, strategie a financování. Zpráva Světové zdravotnické organizace za rok 2009.
4. Schoeman J, Wait J, Burger M, van Zyl F, Fertig G, van Rensburg AJ a kol. Dlouhodobé sledování dětské tuberkulózní meningitidy. Vývojová medicína a dětská neurologie. 2002;44(8):522-6. https://doi.org/10.1111/j.1469-8749.2002.tb00323.x
5. Donald PR, Cotton MF, Hendricks MK, Schaaf HS, de Villiers JN, Willemse TE. Dětská meningitida v provincii Western Cape v Jižní Africe. Časopis tropické pediatrie. 1996;42(5):256-61. doi: 10.1093/tropej/42.5.256.
6. Thwaites GE, van Toorn R, Schoeman J. Tuberkulózní meningitida: více otázek, stále příliš málo odpovědí. Neurologie Lancet. 2013;12(10):999-1010. doi: 10.1016/S1474-4422(13)70168-6
7. Hosoglu S, Geyik MF, Balik I, Aygen B, Erol S, Aygencel TG a kol. Prediktory výsledku u pacientů s tuberkulózní meningitidou. Mezinárodní žurnál tuberkulózy a plicních nemocí: oficiální žurnál Mezinárodní unie proti tuberkulóze a plicním nemocem. 2002;6(1):64-70. PMID: 11931403
8. van Well GT, Paes BF, Terwee CB, Springer P, Roord JJ, Donald PR a kol. Dvacet let dětské tuberkulózní meningitidy: retrospektivní kohortová studie na západním mysu Jižní Afriky. Pediatrie. 2009;123(1):el-8. doi: 10.1542/peds.2008-1353
9. Bahr NC, Marais S, Caws M, van Crevel R, Wilkinson RJ, Tyagi JS a kol. GeneXpert MTB/Rif k diagnostice tuberkulózní meningitidy: Možná první test, ale ne poslední. Klinická infekční onemocnění: oficiální publikace Infectious Diseases Society of America. 2016;62(9):1133-5. doi: 10.1093/cid/ciw083
10. Bahr NC, Nuwagira E, Evans EE, Cresswell FV, Bystrom PV, Byamukama A, et al. Diagnostická přesnost Xpert MTB/RIF Ultra pro tuberkulózní meningitidu u dospělých infikovaných HIV: prospektivní kohortová studie. The Lancet Infekční nemoci. 2018;18(1):68-75. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30474-7.
11. Marais SW, Wilkinson R J. Diagnostika a léčba tuberkulózní meningitidy u dospělých. Jihoafrický lékařský časopis. 2014;104(12). DOI:10.7196/SAMJ.9060
12. Solomons R, Grantham M, Marais BJ, van Toorn R. Indikátory IMCI dětské TBM na úrovni primární zdravotní péče v provincii Western Cape v Jižní Africe. Mezinárodní žurnál tuberkulózy a plicních nemocí: oficiální žurnál Mezinárodní unie proti tuberkulóze a plicním nemocem. 2016;20(10):1309-13. DOI: 10.5588/ijtld.16.0062
13. Bhigjee AI, Padayachee R, Paruk H, Hallwirth-Pillay KD, Marais S, Connoly C. Diagnostika tuberkulózní meningitidy: klinické a laboratorní parametry. International Journal of Infectious Diseases: IJID: oficiální publikace Mezinárodní společnosti pro infekční nemoci. 2007;11(4):348-54. DOI: 10.1016/j.ijid.2006.07.007
14. Marais S, Thwaites G, Schoeman JF, Torok ME, Misra UK, Prasad K a kol. Tuberkulózní meningitida: jednotná definice případu pro použití v klinickém výzkumu. The Lancet Infekční nemoci. 2010;10(11):803-12. doi: 10.1016/S1473-3099(10)70138-9
15. Goenka A, Jeena PM, Mlisana K, Solomon T, Spicer K, Stephenson R, et al. Rychlá a přesná identifikace tuberkulózní meningitidy mezi jihoafrickými dětmi pomocí nového nástroje klinického rozhodování. Časopis dětských infekčních nemocí. 2018;37(3):229-34. DOI: 10.1097/INF.0000000000001726
16. Andronikou S, Wilmshurst J, Hatherill M, VanToorn R. Distribuce mozkového infarktu u dětí s tuberkulózní meningitidou a korelace s výsledným skóre po 6 měsících. Dětská radiologie. 2006;36(12):1289-94. DOI: 10.1007/s00247-006-0319-7
17. Saitoh A, Pong A, Waecker NJ, Jr., Leake JA, Nespeca MP, Bradley JS. Predikce neurologických následků u dětské tuberkulózní meningitidy: přehled 20 případů a návrh nového skórovacího systému. Časopis dětských infekčních nemocí. 2005;24(3):207-12. DOI: 10.1097/01.inf.0000154321.61866.2d
18. Světová zdravotnická organizace. Zpráva z jednání: Profily vysoce prioritních cílových produktů pro novou diagnostiku tuberkulózy: zpráva z konsensuálního setkání. Ženeva: Světová zdravotnická organizace; 2014 28.–29. dubna 2014.
19. Visser DH, Solomons RS, Ronacher K, van Well GT, Heymans MW, Walzl G a kol. Imunitní odpověď hostitele na tuberkulózní meningitidu. Klinická infekční onemocnění: oficiální publikace Infectious Diseases Society of America. 2015;60(2):177-87. doi: 10.1093/cid/ciu781
20. Chegou NN, Sutherland JS, Malherbe S, Crampin AC, Corstjens PL, Geluk A, et al. Diagnostický výkon biologického podpisu sedmimarkerového sérového proteinu pro diagnostiku aktivního onemocnění TBC u účastníků afrických klinik primární zdravotní péče se známkami a symptomy naznačujícími TBC. Hrudník. 2016. Hrudník. 2016;71(9):785-94. doi: 10.1136/thoraxjnl-2015-207999
21. Jacobs R, Malherbe S, Loxton AG, Stanley K, van der Spuy G, Walzl G, a kol. Identifikace nových hostitelských biomarkerů v plazmě jako kandidátů pro imunodiagnostiku tuberkulózního onemocnění a sledování odpovědi na léčbu tuberkulózy. Oncotarget. 2016;7(36):57581-92. doi: 10.18632/oncotarget.11420
22. Neveling DP, van den Heever TS, Perold WJ, Dicks LMT. Nanoforce ZnO nanodrátový biosenzor pro detekci a kvantifikaci imunoglobulinů. Senzory a akční členy B. 2014;203:102-10. https://doi.org/10.1016/j.snb.2014.06.076
23. Maas MB, Maybery GHC, Perold WJ, Neveling DP, Dicks LMT. Borosilikátový skleněný optický biosenzor pro detekci Escherichia coli. Současná mikrobiologie. 2018;75(2):150-5. doi: 10.1007/s00284-017-1359-y.
24. Corstjens PL, Tjon Kon Fat EM, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Franken KL, Chegou NN a kol. Multicentrické vyhodnocení uživatelsky přívětivého laterálního průtokového testu pro stanovení hladin IP-10 a CCL4 v krvi u pacientů s TBC a bez TBC v Africe. Klinická biochemie. 2016;49(1-2):22-31. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2015.08.013
25. Sutherland JS, Mendy J, Gindeh A, Walzl G, Togun T, Owolabi O a kol. Použití testů laterálního průtoku ke stanovení hladin IP-10 a CCL4 v pleurálních výpotcích a plné krvi pro diagnostiku TBC. Tuberkulóza (Edinburgh, Skotsko). 2016;96:31-6. doi: 10.1016/j.tube.2015.10.011.
26. Marais BJ, Heemskerk AD, Marais SS, van Crevel R, Rohlwink U, Caws M a kol. Standardizované metody pro zvýšenou kvalitu a srovnatelnost studií tuberkulózní meningitidy. Klinická infekční onemocnění: oficiální publikace Infectious Diseases Society of America. 2017;64(4):501-9. doi: 10.1093/cid/ciw757.
27. Kashyap RS, Dobos KM, Belisle JT, Purohit HJ, Chandak NH, Taori GM a kol. Průkaz složek komplexu antigenu 85 v mozkomíšním moku pacientů s tuberkulózní meningitidou. Klinická a diagnostická laboratorní imunologie. 2005;12(6):752-8. DOI: 10.1128/CDLI.12.6.752-758.2005
28. du Preez K, Seddon JA, Schaaf HS, Hesseling AC, Starke JR, Osman M a kol. Globální nedostatek BCG vakcíny a tuberkulózní meningitida u dětí. The Lancet Global Health. 2019;7(1):e28-e9. DOI:10.1016/S2214-109X(18)30474-1