Avaliação de novas abordagens baseadas em biomarcadores para melhorar o diagnóstico de meningite tuberculosa infantil (TBMBIOMARKER)

IMPORTÂNCIA E RELEVÂNCIA PARA EDCTP2 Apesar dos consideráveis ​​esforços em curso no desenvolvimento de ferramentas para combater a tuberculose (TB), a doença foi responsável por aproximadamente 1,6 milhões de mortes, com 10 milhões de pessoas a desenvolverem a doença em todo o mundo em 2017 (1). Estima-se que um milhão de crianças adoeceu com tuberculose em 2017 (1, 2). Oito países na África ou na Ásia, incluindo África do Sul, Nigéria, Índia, China, Indonésia, Filipinas, Paquistão e Bangladesh, são responsáveis ​​por dois terços da carga total de TB no mundo (1). A incidência de tuberculose na África do Sul aumentou de 301 novos casos/100.000 em 1990 para 948/100.000 em 2007 (3). A carga de tuberculose é agravada pela pandemia de HIV, que é desenfreada na África do Sul e em outros países africanos. A meningite tuberculosa (TBM) é a forma mais grave de TB, ocorre principalmente na primeira infância e apresenta alta morbimortalidade, devido ao atraso no diagnóstico e início da terapia adequada (4). TBM é o tipo mais comum de meningite bacteriana na província de Western Cape na África do Sul (5).

Novos testes de diagnóstico TBM são necessários. Apesar da pesquisa em andamento, faltam ferramentas de diagnóstico precoce e econômicas para TBM (6). A detecção de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) no líquido cefalorraquidiano (LCR) é o padrão-ouro para o diagnóstico de TBM. Infelizmente, a sensibilidade da baciloscopia e da cultura para TBM é baixa (7, 8). Dependendo do padrão de referência empregado, a sensibilidade do teste GeneXpert (Cepheid Inc, EUA) para TBM é de aproximadamente 50-60%, e melhorou para 72% quando CSF ​​centrifugado foi usado em um estudo (9). Em um estudo publicado mais recentemente realizado em adultos HIV positivos, no entanto, o GeneXpert teve uma sensibilidade de 43% ou 45%, em comparação com 43% ou 45% para cultura e 70% ou 95% para o GeneXpert Ultra, dependendo de qual dos dois padrões de referência foram usados ​​(10). Apesar do lançamento relativamente alto do teste GeneXpert na África do Sul, o teste é atualmente oferecido principalmente em laboratórios centralizados. A disponibilidade do teste em outros países africanos é limitada. O diagnóstico de TB baseia-se na triagem de sintomas pouco sensível e na microscopia de baciloscopia, especialmente nos centros de saúde rurais. As instalações de cultura de Mtb geralmente estão disponíveis apenas em laboratórios de nível de referência e os resultados podem levar até 42 dias. A necessidade de múltiplas visitas de cuidados de saúde leva à perda de acompanhamento e atraso no diagnóstico, alimentando a propagação da tuberculose e danos pulmonares avançados. No caso específico da TBM, o diagnóstico adequado só é feito na admissão em um centro de referência de nível terciário. Na prática clínica de rotina, o diagnóstico é baseado principalmente em uma combinação de achados clínicos, múltiplos exames laboratoriais no LCR, achados de imagem e exclusão de diagnósticos diferenciais comuns (11). A maioria dessas técnicas não está disponível em muitos ambientes de alta sobrecarga, mas com recursos limitados na maior parte da África subsaariana. As crianças atendidas em unidades de saúde primárias e secundárias muitas vezes têm várias oportunidades perdidas, até seis visitas, antes que o diagnóstico final de TBM seja feito em um ambiente com recursos relativamente bons na África do Sul (12). Os achados do LCR podem ser altamente variáveis ​​(13). Recentemente, especialistas internacionais propuseram novas definições de caso uniformes que devem ser empregadas em pesquisas futuras (14, 15) para substituir as muitas definições diferentes na literatura (7, 8, 13, 16, 17). Novos testes são, portanto, urgentemente necessários para o diagnóstico de TBM.

Point-of-care (POC) ou ferramentas de diagnóstico à beira do leito são necessárias na África Subsaariana. Quaisquer novos testes para TBM devem ser rápidos, fáceis de realizar no POC ou à beira do leito e adequados para uso em ambientes com poucos recursos nos países africanos. Tais testes devem, portanto, preferencialmente não utilizar instrumentos de laboratório que requeiram a operação de especialistas. Eles devem usar dispositivos portáteis operados por bateria ou energia solar, adequados para uso por enfermeiras e agentes comunitários de saúde (18). Diagnósticos baseados na resposta imune humana podem fornecer adições importantes, que são facilmente convertidas em POC ou ferramentas de diagnóstico à beira do leito.

Hospede assinaturas de proteínas CSF como candidatos diagnósticos para TBM. Os investigadores investigaram o potencial de marcadores do hospedeiro detectados em amostras de LCR de crianças com suspeita de TBM como candidatos diagnósticos para TBM (19). Os investigadores avaliaram os níveis dos biomarcadores do hospedeiro presentes em um kit padrão de citocinas multiplex BioPlex 27plex (Bio Rad Laboratories) e outros biomarcadores de proteínas em amostras de soro e líquido cefalorraquidiano. Um agrupamento hierárquico não supervisionado e análise de componentes principais, usando o explorador Glucore Omics, revelou agrupamento significativo de pacientes com TBM pelos biomarcadores detectados no LCR.

Uma bioassinatura de proteína hospedeira de 3 marcadores compreendendo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), interleucina (IL)-13 e o peptídeo antibacteriano catelicidina, LL-37, mostrou potencial como uma bioassinatura diagnóstica para TBM (pedido de patente internacional: PCT/IB2015/052751 ) (19), diagnosticando TBM com uma área sob a curva de características do operador receptor (AUC) de 0,91, com sensibilidade de 52%, mas com boa especificidade de 95%. Desde a publicação desta bioassinatura, os investigadores avaliaram o potencial diagnóstico de >70 biomarcadores do hospedeiro em amostras de soro e plasma de adultos com suspeita de TB pulmonar ativa em 5 países africanos diferentes (África do Sul, Namíbia, Malawi, Uganda e Etiópia) em um ensaio financiado pela EDCTP (AE-TBC). Os investigadores identificaram, patentearam (PCT/IB2015/051435 e PCT/IB2017/052142) e publicaram bioassinaturas de proteínas de 6 e 7 marcadores com forte potencial diagnóstico para TB (20, 21).

Em um estudo mais recente (South African Provisional Patent application; Manyelo et al 2019, no prelo), os investigadores levantaram a hipótese de que pelo menos alguns dos biomarcadores do hospedeiro que compreendem nossas bioassinaturas de proteínas adultas podem ser úteis para o diagnóstico de TBM. Financiados pela South African Technology Innovation Agency (PI: Chegou), os investigadores recrutaram prospectivamente uma nova coorte de crianças com suspeita de TBM no Tygerberg Academic Hospital, Western Cape, e determinaram as concentrações de 66 biomarcadores hospedeiros, em amostras de LCR desses crianças. Os investigadores também incluíram os 3 biomarcadores que compunham nossa bioassinatura anterior do LCR para TBM (VEGF, IL-13 e catelicidina LL-37) (19) para fins de validação neste novo estudo; um total de 69 biomarcadores de proteínas hospedeiras.

Com exceção do VEGF (AUC de 0,81), a precisão dos marcadores individuais na assinatura anterior de 3 marcadores foi baixa (AUCs de 0,58 e 0,55, respectivamente, para IL-13 e LL-37), mas quando usados ​​em combinação, o a discriminação entre TBM e não-TBM pelo modelo de 3 marcadores foi confirmada [AUC de 0,67 (95% CI: 0,52-0,83); sensibilidade de 75% e especificidade de 65%]. Quarenta e sete dos marcadores adicionais mostraram diferenças significativas entre os grupos TBM e sem TBM (teste U de Mann Whitney), com 28 mostrando forte potencial diagnóstico, mesmo como marcadores individuais (AUC ≥ 0,80). Esses marcadores incluem interferon (IFN)-γ, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, fator de necrose tumoral (TNF)-α, mieloperoxidase (MPO), matriz metaloproteinase 9 (MMP) , MMP-8, complemento C2 (CC2), IL-10, inibidor total do ativador do plasminogênio 1 (PAI-1), CXCL8, IL-1β, alfa-2-antitripsina (A1AT), CXCL10, fator estimulador de colônias de granulócitos (G- CSF), CC4, CC4b, fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)-AB/BB, apolipoproteína A1 (apoA1), lectina de ligação a manose (MBL), ferritina, CC5a, amilóide sérico P (SAP) e CC5.

As combinações desses biomarcadores foram investigadas e usando modelos de Análise Discriminante Linear (LDA). Uma bioassinatura de CSF de 4 marcadores compreendendo molécula de adesão intracelular solúvel (sICAM)-1, MPO, CXCL8 e IFN-γ diagnosticou TBM com uma AUC de 0,97 (95% CI: 0,92-1,00), com sensibilidade de 87% (20/23) e especificidade de 95,8% (23/24). Após a validação cruzada de deixar um de fora, não houve alteração na sensibilidade e especificidade da bioassinatura de 4 marcadores. A otimização adicional da bioassinatura de 4 marcadores pela seleção de melhores valores de corte resultou em uma sensibilidade e especificidade de 96% e 96%, respectivamente.

Como o VEGF teve um bom desempenho em análises de marcador único (19), os investigadores avaliaram a precisão potencial de outras bioassinaturas que incluíam o VEGF. Um modelo de 3 marcadores compreendendo VEGF, IFN-γ e MPO discriminou com alta precisão entre as crianças com e sem TBM. Na validação cruzada de deixar um de fora e nas otimizações dos melhores valores de corte, a sensibilidade e a especificidade da assinatura baseada em VEGF de 3 marcadores foram de 92% e 100%, respectivamente.

Assinaturas de proteínas do hospedeiro sérico como candidatos diagnósticos para TBM. Todos os 69 marcadores de hospedeiros investigados em amostras de CSF também foram investigados em amostras de soro usando a plataforma Luminex multiplex. Os níveis séricos médios de 17 analitos [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, adipsina, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( total), PDGF AB/BB, MBL e NCAM1] foram significativamente diferentes (p<0,05; Mann Whitney U test) entre crianças com e sem TBM. Quando o potencial diagnóstico de biomarcadores séricos individuais foi avaliado pela análise da curva ROC, 13 dos marcadores apresentaram AUC ≥ 0,70 promissor. LDA demonstrou que o diagnóstico ideal de TBM foi alcançado usando 3 marcadores. A bioassinatura sérica de 3 marcadores mais precisa para o diagnóstico de TBM [adipsina (fator D do complemento), Ab42 e IL-10] diagnosticou TBM com uma AUC de 0,84 (95% CI: 0,73-0,96), uma sensibilidade de 82,6% (19/23) e especificidade de 75% (18/24). Na validação cruzada leave-one-out, a sensibilidade permaneceu 82,6% (19/23) com a especificidade diminuindo para 70,3% (17/24). A otimização adicional da bioassinatura pela seleção de melhores valores de corte resultou em uma sensibilidade e especificidade aprimoradas de 83% e 83%, respectivamente.

Plataforma de diagnóstico baseada em biossensor. Os biomarcadores de soro e CSF de melhor desempenho para TBM serão incorporados a uma nova plataforma de diagnóstico POC a ser desenvolvida na Faculdade de Engenharia, SU. Os investigadores desenvolveram um protótipo de sensor piezoelétrico usando nanofios de ZnO, bem como um elemento sensor resistivo baseado em uma malha de nanofibras eletrofiadas (22). O dispositivo detectou com sucesso E. coli (23). Os investigadores também usaram esta técnica para detectar pequenas quantidades da proteína LC3, um biomarcador para a atividade de autofagia e, como parte de um projeto de mestrado recente, a plataforma foi capaz de detectar IFN-γ, um biomarcador-chave da TB nas faixas fg/ml, demonstrando assim seu potencial de alta sensibilidade.

Usaremos uma abordagem semelhante para desenvolver um teste protótipo baseado em múltiplos biomarcadores que seja capaz de detectar até 4 biomarcadores no soro ou no LCR e avaliar prospectivamente o teste em 300 crianças recém-recrutadas com suspeita de TBM (objetivo 3).

OBJETIVO GERAL O objetivo principal é validar biomarcadores de soro e LCR do hospedeiro previamente identificados e desenvolver um teste POC baseado em biossensor para o diagnóstico de TBM, com base nesses biomarcadores.

Os pesquisadores se propõem a identificar um painel de biomarcadores correlacionados que mostraram potencial em estudos anteriores. Isso será feito para identificar biomarcadores que podem ser substituídos entre si, pois a transição de uma plataforma tecnológica baseada em laboratório, como o Luminex, para um teste POC usando uma tecnologia baseada em biossensores provavelmente enfrentará a perda de alguns dos marcadores devido a razões técnicas ou devido à indisponibilidade de alguns dos marcadores devido à propriedade do anticorpo ou questões de custo. Marcadores altamente correlacionados podem então substituir tais marcadores. Os investigadores testarão qual conjunto de biomarcadores funciona melhor na plataforma de teste de diagnóstico POC. Por fim, os investigadores avaliarão o teste protótipo prospectivamente em uma nova coorte de 300 participantes do estudo com suspeita de TBM, conforme descrito abaixo.

O teste protótipo será baseado na melhor bioassinatura de LCR ou biomarcadores séricos, dependendo de qual apresenta melhor desempenho. No entanto, desenvolver o teste com base em biomarcadores séricos pode ser vantajoso, pois as amostras de LCR são difíceis de coletar. Além disso, um teste baseado em biomarcadores séricos pode ser facilmente convertido em um teste baseado em picada no dedo, que será muito mais fácil de implementar em ambientes com recursos limitados. Os investigadores estão atualmente avaliando um teste de triagem por picada no dedo para tuberculose em adultos com base em biomarcadores do hospedeiro descobertos e validados em amostras de soro como parte de um consórcio financiado pelo EDCTP2 (www.screen-tb.eu).

Referências

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