Оценка новых подходов на основе биомаркеров для улучшения диагностики туберкулезного менингита у детей (TBMBIOMARKER)

ВАЖНОСТЬ И ЗНАЧИМОСТЬ ДЛЯ EDCTP2 Несмотря на значительные постоянные усилия по разработке средств для борьбы с туберкулезом (ТБ), это заболевание стало причиной примерно 1,6 миллиона смертей, при этом в 2017 г. во всем мире болезнь развилась у 10 миллионов человек (1). По оценкам, в 2017 г. туберкулезом заболел один миллион детей (1, 2). На восемь стран Африки или Азии, включая Южную Африку, Нигерию, Индию, Китай, Индонезию, Филиппины, Пакистан и Бангладеш, приходится две трети общего бремени туберкулеза в мире (1). Заболеваемость туберкулезом в Южной Африке выросла с 301 нового случая на 100 000 в 1990 г. до 948 на 100 000 в 2007 г. (3). Бремя туберкулеза усугубляется пандемией ВИЧ, свирепствующей в Южной Африке и других африканских странах. Туберкулезный менингит (ТБМ) является наиболее тяжелой формой туберкулеза, возникает в основном в раннем детстве и характеризуется высокой заболеваемостью и смертностью из-за поздней диагностики и начала соответствующей терапии (4). ТБМ является наиболее распространенным типом бактериального менингита в Западной Капской провинции Южной Африки (5).

Необходимы новые диагностические тесты ТБМ. Несмотря на продолжающиеся исследования, отсутствуют ранние и экономически эффективные средства диагностики ТБМ (6). Обнаружение Mycobacterium tuberculosis (Mtb) в спинномозговой жидкости (ЦСЖ) является золотым стандартом диагностики ТБМ. К сожалению, чувствительность как микроскопии мазка, так и посева на ТБМ низкая (7, 8). В зависимости от используемого эталонного стандарта чувствительность теста GeneXpert (Cepheid Inc, США) для ТБМ составляет примерно 50-60% и повышается до 72% при использовании центрифугированного ЦСЖ в одном исследовании (9). Однако в недавно опубликованном исследовании, проведенном на ВИЧ-позитивных взрослых, GeneXpert показал чувствительность 43% или 45% по сравнению с 43% или 45% для посева и 70% или 95% для GeneXpert Ultra, в зависимости от из двух эталонных стандартов (10). Несмотря на относительно широкое распространение теста GeneXpert в Южной Африке, в настоящее время этот тест в основном предлагается в централизованных лабораториях. Доступность теста в других африканских странах ограничена. Диагноз ТБ основывается на низкочувствительном скрининге симптомов и микроскопии мазка, особенно в сельских медицинских центрах. Помещения для посева Mtb часто доступны только в лабораториях специализированного уровня, и получение результатов может занять до 42 дней. Необходимость многократного обращения за медицинской помощью приводит к потере последующего наблюдения и запоздалой диагностике, что способствует распространению туберкулеза и серьезному поражению легких. В частности, в случае ТБМ правильный диагноз ставится только при поступлении в специализированный центр третичного уровня. В обычной клинической практике диагноз в основном основывается на сочетании клинических данных, множественных лабораторных исследований ЦСЖ, данных визуализации и исключении общих дифференциальных диагнозов (11). Большинство этих методов недоступны во многих странах с высоким бременем, но с ограниченными ресурсами в большинстве стран Африки к югу от Сахары. Дети, наблюдаемые в учреждениях первичной и вторичной медицинской помощи, часто имеют несколько упущенных возможностей, до шести посещений, прежде чем в конечном итоге будет поставлен диагноз ТБМ в относительно хорошо обеспеченных ресурсами условиях в Южной Африке (12). Данные ЦСЖ могут сильно различаться (13). Недавно международные эксперты предложили новые унифицированные определения случаев, которые следует использовать в будущих исследованиях (14, 15), чтобы заменить множество различных определений в литературе (7, 8, 13, 16, 17). Поэтому срочно необходимы новые тесты для диагностики ТБМ.

В странах Африки к югу от Сахары необходимы инструменты для диагностики в местах оказания медицинской помощи (POC) или у постели больного. Любые новые тесты на ТБМ должны быть быстрыми, простыми в проведении в условиях стационара или у постели больного и пригодными для использования в условиях ограниченных ресурсов в африканских странах. Поэтому желательно, чтобы в таких тестах не использовались лабораторные приборы, для работы которых требуются специалисты. Они должны использовать переносные ручные устройства с батарейным или солнечным питанием, подходящие для использования медсестрами и медицинскими работниками по месту жительства (18). Диагностика, основанная на иммунном ответе человека, может предоставить важные дополнения, которые легко преобразовать в POC или прикроватные диагностические инструменты.

Сигнатуры белков спинномозговой жидкости хозяина как диагностические кандидаты на ТБМ. Исследователи изучили потенциал маркеров-хозяев, обнаруженных в образцах спинномозговой жидкости детей с подозрением на ТБМ, в качестве диагностических кандидатов на ТБМ (19). Исследователи оценили уровни биомаркеров хозяина, присутствующих в стандартном наборе мультиплексных цитокинов BioPlex 27plex (Bio Rad Laboratories), и других белковых биомаркеров в образцах спинномозговой жидкости и сыворотки. Неконтролируемая иерархическая кластеризация и анализ основных компонентов с использованием проводника Glucore Omics выявили значительную кластеризацию пациентов с ТБМ по биомаркерам, обнаруженным в спинномозговой жидкости.

Биосигнатура 3-маркерного белка-хозяина, включающая фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), интерлейкин (IL)-13 и антибактериальный пептид кателицидин, LL-37, продемонстрировала потенциал в качестве диагностической биосигнатуры для ТБМ (международная заявка на патент: PCT/IB2015/052751). ) (19), диагностируя ТБМ с площадью под кривой характеристик оператора приемника (AUC) 0,91, с чувствительностью 52%, но с хорошей специфичностью 95%. С момента публикации этой биосигнатуры исследователи оценили диагностический потенциал > 70 биомаркеров хозяина в образцах сыворотки и плазмы взрослых с подозрением на активный легочный ТБ в 5 различных африканских странах (Южная Африка, Намибия, Малави, Уганда и Эфиопия) в исследование, финансируемое EDCTP (AE-TBC). Исследователи выявили, запатентовали (PCT/IB2015/051435 и PCT/IB2017/052142) и опубликовали 6- и 7-маркерные белковые биосигнатуры с сильным диагностическим потенциалом для ТБ (20, 21).

В более позднем исследовании (Предварительная заявка на патент Южной Африки; Manyelo et al 2019, в печати) исследователи выдвинули гипотезу, что по крайней мере некоторые из биомаркеров хозяина, включающие наши биосигнатуры взрослых белков, могут быть полезны для диагностики ТБМ. Финансируемые Южноафриканским агентством технологических инноваций (PI: Chegou), исследователи проспективно зарегистрировали новую когорту детей с подозрением на ТБМ в академической больнице Тайгерберг, Западный Кейп, и определили концентрации 66 биомаркеров хозяина в образцах спинномозговой жидкости из этих дети. Исследователи также включили 3 биомаркера, которые составляли нашу предыдущую биосигнатуру CSF для TBM (VEGF, IL-13 и кателицидин LL-37) (19) для целей проверки в этом новом исследовании; всего 69 биомаркеров белков-хозяев.

За исключением VEGF (AUC 0,81), точность отдельных маркеров в предыдущей 3-маркерной сигнатуре была низкой (AUC 0,58 и 0,55 соответственно для IL-13 и LL-37), но при использовании в комбинации различение между TBM и отсутствием TBM по модели с 3 маркерами было подтверждено [AUC 0,67 (95% ДИ: 0,52-0,83); чувствительность 75% и специфичность 65%]. Сорок семь дополнительных маркеров показали значительные различия между группами ТБМ и без ТБМ (U-критерий Манна-Уитни), при этом 28 продемонстрировали сильный диагностический потенциал даже в качестве отдельных маркеров (AUC ≥ 0,80). Эти маркеры включают интерферон (IFN)-γ, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, фактор некроза опухоли (TNF)-α, миелопероксидазу (MPO), матриксную металлопротеиназу 9 (MMP) , MMP-8, комплемент C2 (CC2), IL-10, общий ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1), CXCL8, IL-1β, альфа-2-антитрипсин (A1AT), CXCL10, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G- CSF), CC4, CC4b, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор роста тромбоцитов (PDGF)-AB/BB, аполипопротеин A1 (apoA1), маннозо-связывающий лектин (MBL), ферритин, CC5a, сывороточный амилоид P (SAP) и CC5.

Комбинации этих биомаркеров исследовали с использованием моделей линейного дискриминантного анализа (LDA). Биосигнатура CSF с 4 маркерами, включающая растворимую молекулу внутриклеточной адгезии (sICAM)-1, MPO, CXCL8 и IFN-γ, диагностировала ТБМ с AUC 0,97 (95% ДИ: 0,92-1,00), с чувствительностью 87% (20/23) и специфичностью 95,8% (23/24). После перекрестной проверки по исключению чувствительность и специфичность 4-маркерной биосигнатуры не изменились. Дальнейшая оптимизация 4-маркерной биосигнатуры путем выбора лучших пороговых значений привела к чувствительности и специфичности 96% и 96% соответственно.

Поскольку VEGF показал хорошие результаты в анализе отдельных маркеров (19), исследователи оценили потенциальную точность других биосигнатур, включающих VEGF. 3-маркерная модель, включающая VEGF, IFN-γ и MPO, позволяла с высокой точностью различать детей с ТБМ и без него. При перекрестной проверке с исключением по одному и оптимизации лучших пороговых значений чувствительность и специфичность 3-маркерной сигнатуры на основе VEGF составляли 92% и 100% соответственно.

Сигнатуры белка-хозяина в сыворотке как диагностические кандидаты на ТБМ. Все 69 маркеров-хозяев, исследованных в образцах спинномозговой жидкости, также были исследованы в образцах сыворотки с использованием мультиплексной платформы Luminex. Средние уровни в сыворотке 17 аналитов [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, адипсин, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( всего), PDGF AB/BB, MBL и NCAM1] достоверно различались (p<0,05; U-критерий Манна-Уитни) между детьми с ТБМ и без него. Когда диагностический потенциал отдельных биомаркеров в сыворотке оценивался с помощью анализа ROC-кривой, 13 маркеров имели перспективную AUC ≥ 0,70. LDA продемонстрировал, что оптимальная диагностика ТБМ была достигнута с использованием 3 маркеров. Наиболее точная 3-маркерная сывороточная биосигнатура для диагностики ТБМ [адипсин (фактор комплемента D), Ab42 и IL-10] диагностировала ТБМ с AUC 0,84 (95% ДИ: 0,73-0,96), чувствительность 82,6% (19/23) и специфичность 75% (18/24). При перекрестной проверке с пропуском по одному чувствительность осталась на уровне 82,6% (19/23), а специфичность снизилась до 70,3% (17/24). Дальнейшая оптимизация биосигнатуры путем выбора лучших пороговых значений привела к повышению чувствительности и специфичности на 83% и 83% соответственно.

Диагностическая платформа на основе биосенсоров. Наиболее эффективные биомаркеры CSF и сыворотки для TBM будут включены в новую диагностическую платформу POC, которая будет разработана на инженерном факультете SU. Исследователи разработали прототип пьезоэлектрического датчика с использованием нанопроволок ZnO, а также резистивный чувствительный элемент на основе сетки из нановолокна, полученного методом электропрядения (22). Устройство успешно обнаружило кишечную палочку (23). Исследователи также использовали этот метод для обнаружения небольших количеств белка LC3, биомаркера активности аутофагии, и в рамках недавнего мастер-проекта платформа была способна обнаруживать IFN-γ, ключевой биомаркер туберкулеза, в диапазонах фг/мл. тем самым демонстрируя свою потенциально высокую чувствительность.

Мы будем использовать аналогичный подход для разработки прототипа теста на основе нескольких биомаркеров, способного обнаруживать до 4 биомаркеров в сыворотке или спинномозговой жидкости, и проспективно оценить тест на 300 вновь набранных детях с подозрением на ТБМ (Цель 3).

ОБЩАЯ ЦЕЛЬ Основная цель состоит в том, чтобы проверить ранее идентифицированные биомаркеры сыворотки и спинномозговой жидкости хозяина, а также разработать основанный на биосенсорах тест POC для диагностики ТБМ на основе этих биомаркеров.

Исследователи предлагают определить панель коррелированных биомаркеров, которые показали потенциал в предыдущих исследованиях. Это будет сделано для выявления биомаркеров, которые можно заменить друг другом, поскольку переход от лабораторной технологической платформы, такой как Luminex, к POC-тесту с использованием технологии на основе биосенсоров, вероятно, столкнется с потерей некоторых маркеров. по техническим причинам или из-за недоступности некоторых маркеров из-за прав собственности на антитела или проблем со стоимостью. Затем такие маркеры могут заменить высококоррелированные маркеры. Исследователи проверят, какой набор биомаркеров лучше всего работает на платформе диагностических тестов POC. Наконец, исследователи проспективно оценят прототип теста в новой когорте из 300 участников исследования с подозрением на ТБМ, как описано ниже.

Тест-прототип будет основан на наилучшей биосигнатуре биомаркеров спинномозговой жидкости или сыворотки, в зависимости от того, что работает лучше всего. Тем не менее, разработка теста на основе биомаркеров сыворотки может быть выгодной, поскольку образцы спинномозговой жидкости трудно собрать. Кроме того, тест, основанный на сывороточных биомаркерах, можно легко преобразовать в тест, основанный на взятии проб из пальца, который будет намного проще внедрить в условиях ограниченных ресурсов. В настоящее время исследователи оценивают скрининговый тест из пальца на туберкулез у взрослых на основе биомаркеров хозяина, обнаруженных и подтвержденных в образцах сыворотки, в рамках консорциума, финансируемого EDCTP2 (www.screen-tb.eu).

использованная литература

1. Всемирная организация здравоохранения. Глобальный отчет по туберкулезу 2018 г.
2. Всемирная организация здравоохранения. Информационный бюллетень о туберкулезе. 2018.
3. Всемирная организация здравоохранения. глобальная борьба с туберкулезом; Эпидемиология, стратегия и финансирование. Доклад Всемирной организации здравоохранения за 2009 г.
4. Шуман Дж., Уэйт Дж., Бургер М., ван Зил Ф., Фертиг Г., ван Ренсбург А.Дж. и др. Длительное наблюдение за туберкулезным менингитом у детей. Развивающая медицина и детская неврология. 2002;44(8):522-6. https://doi.org/10.1111/j.1469-8749.2002.tb00323.x
5. Дональд П.Р., Коттон М.Ф., Хендрикс М.К., Шааф Х.С., де Вильерс Дж.Н., Виллемс Т.Э. Детский менингит в Западной Капской провинции Южной Африки. Журнал тропической педиатрии. 1996;42(5):256-61. doi: 10.1093/тропей/42.5.256.
6. Туэйтс Г.Э., ван Торн Р., Шуман Дж. Туберкулезный менингит: больше вопросов, но еще слишком мало ответов. Ланцет Неврология. 2013;12(10):999-1010. дои: 10.1016/S1474-4422(13)70168-6
7. Хосоглу С., Гейик М.Ф., Балик И., Айген Б., Эрол С., Айгенцел Т.Г. и др. Предикторы исхода у больных туберкулезным менингитом. Международный журнал туберкулеза и болезней легких: официальный журнал Международного союза борьбы с туберкулезом и болезнями легких. 2002;6(1):64-70. PMID: 11931403
8. van Well GT, Paes BF, Terwee CB, Springer P, Roord JJ, Donald PR и др. Двадцать лет туберкулезного менингита у детей: ретроспективное когортное исследование в западной части Южной Африки. Педиатрия. 2009;123(1):e1-8. doi: 10.1542/пед.2008-1353
9. Bahr NC, Marais S, Caws M, van Crevel R, Wilkinson RJ, Tyagi JS, et al. GeneXpert MTB/Rif для диагностики туберкулезного менингита: возможно, первый тест, но не последний. Клинические инфекционные заболевания: официальное издание Американского общества инфекционистов. 2016;62(9):1133-5. Дои: 10.1093/cid/ciw083
10. Bahr NC, Nuwagira E, Evans EE, Cresswell FV, Bystrom PV, Byamukama A, et al. Точность диагностики туберкулезного менингита у ВИЧ-инфицированных взрослых с помощью Xpert MTB/RIF Ultra: проспективное когортное исследование. Ланцет Инфекционные болезни. 2018;18(1):68-75. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30474-7.
11. Marais SW, Wilkinson R J. Диагностика и лечение туберкулезного менингита у взрослых. Южноафриканский медицинский журнал. 2014;104(12). DOI: 10.7196/SAMJ.9060
12. Соломонс Р., Грантам М., Марэ Б.Дж., ван Торн Р. Показатели ИВБДВ детского ТБМ на уровне первичной медико-санитарной помощи в провинции Западный Кейп в Южной Африке. Международный журнал туберкулеза и болезней легких: официальный журнал Международного союза борьбы с туберкулезом и болезнями легких. 2016;20(10):1309-13. DOI: 10.5588/ijtld.16.0062
13. Бхигджи ​​А.И., Падаячи Р., Парук Х., Холлвирт-Пиллэй К.Д., Марэ С., Конноли С. Диагностика туберкулезного менингита: клинические и лабораторные параметры. Международный журнал инфекционных заболеваний: IJID: официальное издание Международного общества инфекционных заболеваний. 2007;11(4):348-54. DOI: 10.1016/j.ijid.2006.07.007
14. Марэ С., Туэйтес Г., Шуман Дж. Ф., Торок М. Е., Мисра Великобритания, Прасад К. и др. Туберкулезный менингит: единообразное определение случая для использования в клинических исследованиях. Ланцет Инфекционные болезни. 2010;10(11):803-12. дои: 10.1016/S1473-3099(10)70138-9
15. Гоенка А., Джина П.М., Млисана К., Соломон Т., Спайсер К., Стивенсон Р. и др. Быстрая и точная идентификация туберкулезного менингита среди южноафриканских детей с использованием нового инструмента для принятия клинических решений. Журнал детских инфекционных болезней. 2018;37(3):229-34. DOI: 10.1097/INF.0000000000001726
16. Andronikou S, Wilmshurst J, Hatherill M, VanToorn R. Распределение инфаркта головного мозга у детей с туберкулезным менингитом и корреляция с оценкой исхода через 6 месяцев. Детская радиология. 2006;36(12):1289-94. DOI: 10.1007/s00247-006-0319-7
17. Сайто А., Понг А., Векер Н.Дж., младший, Лик Дж.А., Неспека М.П., ​​Брэдли Дж.С. Прогнозирование неврологических осложнений при туберкулезном менингите у детей: обзор 20 случаев и предложение новой системы оценки. Журнал детских инфекционных болезней. 2005;24(3):207-12. DOI: 10.1097/01.inf.0000154321.61866.2d
18. Всемирная организация здравоохранения. Отчет о совещании: Профили высокоприоритетных целевых продуктов для новой диагностики туберкулеза: отчет о консенсусном совещании. Женева: Всемирная организация здравоохранения; 2014 28-29 апреля 2014.
19. Виссер Д.Х., Соломонс Р.С., Ронахер К., ван Велл Г.Т., Хейманс М.В., Уолцл Г. и др. Иммунный ответ хозяина на туберкулезный менингит. Клинические инфекционные заболевания: официальное издание Американского общества инфекционистов. 2015;60(2):177-87. Дои: 10.1093/cid/ciu781
20. Chegou NN, Sutherland JS, Malherbe S, Crampin AC, Corstjens PL, Geluk A, et al. Диагностическая эффективность семимаркерной биосигнатуры сывороточного белка для диагностики активного туберкулеза у пациентов африканских клиник первичной медико-санитарной помощи с признаками и симптомами, указывающими на туберкулез. грудная клетка. 2016. грудная клетка. 2016;71(9):785-94. doi: 10.1136/thoraxjnl-2015-207999
21. Джейкобс Р., Малерб С., Локстон А.Г., Стэнли К., ван дер Спуи Г., Уолцл Г. и др. Идентификация новых биомаркеров хозяина в плазме в качестве кандидатов для иммунодиагностики туберкулеза и мониторинга ответа на лечение туберкулеза. Онкотаргет. 2016;7(36):57581-92. doi: 10.18632/oncotarget.11420
22. Neveling DP, van den Heever TS, Perold WJ, Dicks LMT. Биосенсор нанопроводной матрицы ZnO nanoforce для обнаружения и количественного определения иммуноглобулинов. Датчики и приводы Б. 2014;203:102-10. https://doi.org/10.1016/j.snb.2014.06.076
23. Маас М.Б., Мэйбери ГХК, Перольд В.Дж., Невелинг Д.П., Дикс ЛМТ. Волоконно-оптический биосенсор из боросиликатного стекла для обнаружения кишечной палочки. Современная микробиология. 2018;75(2):150-5. doi: 10.1007/s00284-017-1359-y.
24. Corstjens PL, Tjon Kon Fat EM, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Franken KL, Chegou NN, et al. Многоцентровая оценка удобного для пользователя анализа латерального потока для определения уровней IP-10 и CCL4 в крови больных ТБ и нетуберкулезных больных в Африке. Клиническая биохимия. 2016;49(1-2):22-31. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2015.08.013
25. Sutherland JS, Mendy J, Gindeh A, Walzl G, Togun T, Owolabi O, et al. Использование анализов латерального потока для определения уровней IP-10 и CCL4 в плевральном выпоте и цельной крови для диагностики туберкулеза. Туберкулез (Эдинбург, Шотландия). 2016;96:31-6. doi: 10.1016/j.tube.2015.10.011.
26. Марэ Б.Дж., Хемскерк А.Д., Марэ С.С., ван Кревель Р., Ролвинк У., Коус М. и др. Стандартизированные методы повышения качества и сопоставимости исследований туберкулезного менингита. Клинические инфекционные заболевания: официальное издание Американского общества инфекционистов. 2017;64(4):501-9. doi: 10.1093/cid/ciw757.
27. Кашьяп Р.С., Добос К.М., Белисл Дж.Т., Пурохит Х.Дж., Чандак Н.Х., Таори Г.М. и др. Демонстрация компонентов комплекса антигена 85 в спинномозговой жидкости больных туберкулезным менингитом. Клинико-диагностическая лабораторная иммунология. 2005;12(6):752-8. DOI: 10.1128/CDLI.12.6.752-758.2005
28. дю Приз К., Седдон Дж. А., Шааф Х. С., Хесселинг А. С., Старке Дж. Р., Осман М. и др. Глобальный дефицит вакцины БЦЖ и туберкулезный менингит у детей. Ланцет Глобальное здоровье. 2019;7(1):e28-e9. DOI: 10.1016/S2214-109X(18)30474-1