Evaluering av nye biomarkørbaserte tilnærminger for å forbedre diagnosen av tuberkuløs meningitt i barndommen (TBMBIOMARKER)

VIKTIGHET OG RELEVANS FOR EDCTP2 Til tross for betydelig pågående innsats i utviklingen av verktøy for å bekjempe tuberkulose (TB), var sykdommen ansvarlig for omtrent 1,6 millioner dødsfall, med 10 millioner mennesker som utviklet sykdommen over hele verden i 2017 (1). Anslagsvis en million barn ble syke av tuberkulose i 2017 (1, 2). Åtte land i Afrika eller Asia inkludert Sør-Afrika, Nigeria, India, Kina, Indonesia, Filippinene, Pakistan og Bangladesh sto for to tredjedeler av verdens totale TB-byrde (1). TB-forekomsten i Sør-Afrika steg fra 301 nye tilfeller/100 000 i 1990 til 948/100 000 i 2007 (3). TB-byrden forverres av HIV-pandemien, som er utbredt i Sør-Afrika og andre afrikanske land. Tuberkuløs meningitt (TBM) er den alvorligste formen for tuberkulose, forekommer mest i tidlig barndom og har høy sykelighet og dødelighet på grunn av forsinket diagnose og igangsetting av passende behandling (4). TBM er den vanligste typen bakteriell meningitt i Western Cape-provinsen i Sør-Afrika (5).

Nye TBM diagnostiske tester er nødvendig. Til tross for pågående forskning mangler tidlige og kostnadseffektive diagnostiske verktøy for TBM (6). Påvisning av Mycobacterium tuberculosis (Mtb) i cerebrospinalvæske (CSF) er gullstandarden for diagnostisering av TBM. Dessverre er sensitiviteten til både utstryksmikroskopi og kultur for TBM lav (7, 8). Avhengig av referansestandarden som brukes, er sensitiviteten til GeneXpert-testen (Cepheid Inc, USA) for TBM omtrent 50-60 %, og forbedret til 72 % når sentrifugert CSF ble brukt i en studie (9). I en nylig publisert studie utført på HIV-positive voksne, presterte imidlertid GeneXpert med en sensitivitet på 43 % eller 45 %, sammenlignet med 43 % eller 45 % for kultur og 70 % eller 95 % for GeneXpert Ultra, avhengig av hvilken av de to referansestandardene ble brukt (10). Til tross for den relativt høye utrullingen av GeneXpert-testen over hele Sør-Afrika, tilbys testen for tiden for det meste ved sentraliserte laboratorier. Tilgjengeligheten av testen i andre afrikanske land er begrenset. Diagnosen TB er avhengig av dårlig sensitiv symptomscreening og utstryksmikroskopi, spesielt ved helsestasjoner på landsbygda. Mtb-kulturanlegg er ofte bare tilgjengelig på henvisningsnivålaboratorier, og resultatene kan ta opptil 42 dager. Behovet for flere helsebesøk fører til tap av oppfølging og forsinket diagnose, noe som fremmer spredning av tuberkulose og avansert lungeskade. Når det gjelder TBM spesielt, stilles riktig diagnose først ved innleggelse i et videregående henvisningssenter. I rutinemessig klinisk praksis er diagnosen for det meste basert på en kombinasjon av kliniske funn, flere laboratorietester på CSF, bildediagnostiske funn og utelukkelse av vanlige differensialdiagnoser (11). De fleste av disse teknikkene er utilgjengelige i mange høybyrde, men ressursbegrensede omgivelser i det meste av Afrika sør for Sahara. Barn som sees ved primær- og sekundærhelsetjenester har ofte flere tapte muligheter, opptil seks besøk, før en eventuell diagnose av TBM stilles i en relativt ressurssterk setting i Sør-Afrika (12). Funn fra CSF kan være svært varierende (13). Nylig har internasjonale eksperter foreslått nye enhetlige kasusdefinisjoner som bør brukes i fremtidig forskning (14, 15) for å erstatte de mange forskjellige definisjonene i litteraturen (7, 8, 13, 16, 17). Det er derfor et presserende behov for nye tester for diagnostisering av TBM.

Point-of-care (POC) eller diagnostiske verktøy ved sengen er nødvendig i Afrika sør for Sahara. Eventuelle nye tester for TBM må være raske, enkle å utføre ved POC eller sengen, og egnet for bruk i ressurssvake omgivelser i afrikanske land. Slike tester bør derfor helst ikke bruke laboratorieinstrumenter som krever spesialister for å operere. De bør bruke bærbare batteri- eller solcelledrevne håndholdte enheter, egnet for bruk av sykepleiere og helsearbeidere (18). Diagnostikk basert på den menneskelige immunresponsen kan gi viktige tillegg, som enkelt konverteres til POC eller diagnostiske verktøy ved sengen.

Vert CSF-proteinsignaturer som diagnostiske kandidater for TBM. Etterforskerne undersøkte potensialet til vertsmarkører påvist i CSF-prøver fra barn mistenkt for å ha TBM som diagnostiske kandidater for TBM (19). Etterforskerne evaluerte nivåene av vertsbiomarkørene til stede i et standard BioPlex 27plex multipleks cytokinsett (Bio Rad Laboratories) og andre proteinbiomarkører i CSF og serumprøver. En uovervåket hierarkisk clustering og hovedkomponentanalyse, ved bruk av Glucore Omics explorer, avslørte betydelig clustering av pasienter med TBM av biomarkørene som ble oppdaget i CSF.

En 3-markør vertsproteinbiosignatur som omfatter vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), interleukin (IL)-13 og det antibakterielle peptidet cathelicidin, LL-37, viste potensial som en diagnostisk biosignatur for TBM (internasjonal patentsøknad: PCT/IB2015/052751 ) (19), diagnostisering av TBM med et område under mottakeroperatørens karakteristika (AUC) på 0,91, med sensitivitet på 52 %, men med god spesifisitet på 95 %. Siden publiseringen av denne biosignaturen har etterforskerne evaluert det diagnostiske potensialet til >70 vertsbiomarkører i serum- og plasmaprøver fra voksne mistenkt for å ha aktiv lunge-TB i 5 forskjellige afrikanske land (Sør-Afrika, Namibia, Malawi, Uganda og Etiopia) i en EDCTP-finansiert studie (AE-TBC). Etterforskerne identifiserte, patenterte (PCT/IB2015/051435 og PCT/IB2017/052142), og publiserte 6- og 7-markørproteinbiosignaturer med sterkt diagnostisk potensial for TB (20, 21).

I en nyere studie (South African Provisional Patent application; Manyelo et al 2019, in press), antok etterforskerne at i det minste noen av vertsbiomarkørene som utgjør biosignaturene våre for voksne proteiner kan være nyttige for TBM-diagnostikk. Finansiert av South African Technology Innovation Agency (PI: Chegou), registrerte etterforskerne prospektivt en ny gruppe barn mistenkt for å ha TBM ved Tygerberg Academic Hospital, Western Cape, og bestemte konsentrasjonene av 66 vertsbiomarkører, i CSF-prøver fra disse barn. Etterforskerne inkluderte også de 3 biomarkørene som utgjorde vår tidligere CSF-biosignatur for TBM (VEGF, IL-13 og cathelicidin LL-37) (19) for valideringsformål i denne nye studien; totalt 69 vertsproteinbiomarkører.

Med unntak av VEGF (AUC på 0,81), var nøyaktigheten til de individuelle markørene i den forrige 3-markørsignaturen dårlig (AUC på henholdsvis 0,58 og 0,55 for IL-13 og LL-37), men når de brukes i kombinasjon, diskriminering mellom TBM og ikke-TBM ved 3-markørmodellen ble bekreftet [AUC på 0,67 (95 % KI: 0,52-0,83); sensitivitet på 75 % og spesifisitet på 65 %]. Førtisyv av de ekstra markørene viste signifikante forskjeller mellom TBM og ingen TBM-gruppene (Mann Whitney U-test), med 28 som viste sterkt diagnostisk potensial, selv som individuelle markører (AUC ≥ 0,80). Disse markørene inkluderer interferon (IFN)-y, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, tumornekrosefaktor (TNF)-α, myeloperoksidase (MPO), matrisemetalloproteinase 9 (MMP) , MMP-8, komplement C2 (CC2), IL-10, total plasminogenaktivatorhemmer 1 (PAI-1), CXCL8, IL-1β, alfa-2-antitrypsin(A1AT), CXCL10, granulocyttkolonistimulerende faktor (G- CSF), CC4, CC4b, granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF), blodplateavledet vekstfaktor (PDGF)-AB/BB, apolipoprotein A1 (apoA1), mannosebindende lektin (MBL), ferritin, CC5a, serumamyloid P (SAP) og CC5.

Kombinasjoner av disse biomarkørene ble undersøkt og ved bruk av Linear Discriminant Analysis (LDA) modeller. En 4-markør CSF-biosignatur som omfatter løselig intracellulært adhesjonsmolekyl (sICAM)-1, MPO, CXCL8 og IFN-γ diagnostisert TBM med en AUC på 0,97 (95 % KI: 0,92-1,00), med en sensitivitet på 87 % (20/23) og spesifisitet på 95,8 % (23/24). Etter forlate-en-ut kryssvalidering var det ingen endring i sensitiviteten og spesifisiteten til 4-markør biosignaturen. Ytterligere optimalisering av 4-markør biosignaturen ved å velge bedre grenseverdier resulterte i en sensitivitet og spesifisitet på henholdsvis 96 % og 96 %.

Ettersom VEGF presterte godt i enkeltmarkøranalyser (19), evaluerte etterforskerne den potensielle nøyaktigheten til andre biosignaturer som inkluderte VEGF. En 3-markørmodell bestående av VEGF, IFN-γ og MPO diskriminerte med høy nøyaktighet mellom barna med og uten TBM. I leave-one-out kryssvalidering og optimaliseringer av beste grenseverdier, var sensitiviteten og spesifisiteten til den 3-markør VEGF-baserte signaturen henholdsvis 92 % og 100 %.

Serumvertsproteinsignaturer som diagnostiske kandidater for TBM. Alle 69 vertsmarkører som ble undersøkt i CSF-prøver ble også undersøkt på serumprøver ved bruk av Luminex multipleks-plattformen. Median serumnivåer av 17 analytter [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, adipsin, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( totalt), PDGF AB/BB, MBL og NCAM1] var signifikant forskjellige (p<0,05; Mann Whitney U-test) mellom barn med og uten TBM. Når det diagnostiske potensialet til individuelle serumbiomarkører ble vurdert ved ROC-kurveanalyse, hadde 13 av markørene lovende AUC ≥ 0,70. LDA viste at optimal diagnose av TBM ble oppnådd ved bruk av 3 markører. Den mest nøyaktige 3-markør serumbiosignaturen for diagnostisering av TBM [adipsin (komplementfaktor D), Ab42 og IL-10] diagnostiserte TBM med en AUC på 0,84 (95 % KI: 0,73-0,96), en sensitivitet på 82,6 % (19/23) og spesifisitet på 75 % (18/24). Ved forlate-en-ut kryssvalidering forble sensitiviteten 82,6 % (19/23) med spesifisiteten redusert til 70,3 % (17/24). Ytterligere optimalisering av biosignaturen ved valg av bedre grenseverdier resulterte i en forbedret sensitivitet og spesifisitet på henholdsvis 83 % og 83 %.

Biosensorbasert diagnostisk plattform. De beste CSF- og serumbiomarkørene for TBM vil bli innlemmet i en ny POC-diagnoseplattform som skal utvikles ved Ingeniørfakultetet, SU. Etterforskerne har utviklet en prototype piezoelektrisk sensor ved bruk av ZnO nanotråder, samt et resistivt sensorelement basert på et elektrospunnet nanofibernett (22). Enheten påviste E. coli (23). Etterforskerne har også brukt denne teknikken for å oppdage små mengder av proteinet LC3, en biomarkør for autofagi-aktivitet, og som en del av et nylig masterprosjekt var plattformen i stand til å oppdage IFN-γ, en viktig TB-biomarkør i fg/ml-områder, demonstrerer dermed dens potensielle høysensitivitet.

Vi vil bruke en lignende tilnærming for å utvikle en multi-biomarkørbasert prototypetest som er i stand til å oppdage opptil 4 biomarkører i serum eller CSF, og prospektivt evaluere testen på 300 nyrekrutterte barn med mistenkt TBM (Mål 3).

OVERORDNET MÅL Hovedmålet er å validere tidligere identifiserte vertsserum og CSF-biomarkører og å utvikle en biosensorbasert POC-test for diagnostisering av TBM, basert på disse biomarkørene.

Etterforskerne foreslår å identifisere et panel av korrelerte biomarkører som viste potensial i tidligere studier. Dette vil bli gjort for å identifisere biomarkører som kan erstattes med hverandre ettersom overgangen fra en laboratoriebasert teknologisk plattform som Luminex til en POC-test ved bruk av en biosensorbasert teknologi sannsynligvis vil stå overfor tap av noen av markørene på grunn av tekniske årsaker eller på grunn av utilgjengelighet av noen av markørene på grunn av antistoffeierskap eller kostnadsproblemer. Høyt korrelerte markører kan da erstatte slike markører. Etterforskerne vil teste hvilket sett med biomarkører som fungerer best i POC-diagnosetestplattformen. Til slutt vil etterforskerne evaluere prototypetesten prospektivt i en ny kohort på 300 studiedeltakere med mistenkt TBM som beskrevet nedenfor.

Prototypetesten vil være basert på den beste biosignaturen til CSF eller serumbiomarkører, avhengig av hvilken som gir best ytelse. Det kan imidlertid være fordelaktig å utvikle testen basert på serumbiomarkører ettersom CSF-prøver er vanskelige å samle inn. Videre kan en test basert på serumbiomarkører enkelt konverteres til en fingerstikkbasert test, som vil være mye enklere å implementere i ressursbegrensede innstillinger. Etterforskerne evaluerer for tiden en fingerstikk-screeningstest for voksen TB basert på vertsbiomarkører oppdaget og validert i serumprøver som en del av et EDCTP2-finansiert konsortium (www.screen-tb.eu).

Referanser

1. Verdens helseorganisasjon. Global tuberkuloserapport 2018.
2. Verdens helseorganisasjon. Faktaark om tuberkulose. 2018.
3. Verdens helseorganisasjon. Global tuberkulosekontroll; Epidemiologi, strategi og finansiering. Verdens helseorganisasjons rapport 2009.
4. Schoeman J, Wait J, Burger M, van Zyl F, Fertig G, van Rensburg AJ, et al. Langtidsoppfølging av tuberkuløs meningitt i barndommen. Utviklingsmedisin og barnenevrologi. 2002;44(8):522-6. https://doi.org/10.1111/j.1469-8749.2002.tb00323.x
5. Donald PR, Cotton MF, Hendricks MK, Schaaf HS, de Villiers JN, Willemse TE. Pediatrisk meningitt i Western Cape-provinsen i Sør-Afrika. Journal of tropical pediatrics. 1996;42(5):256-61. doi: 10.1093/tropej/42.5.256.
6. Thwaites GE, van Toorn R, Schoeman J. Tuberkuløs meningitt: flere spørsmål, fortsatt for få svar. The Lancet Neurology. 2013;12(10):999-1010. doi: 10.1016/S1474-4422(13)70168-6
7. Hosoglu S, Geyik MF, Balik I, Aygen B, Erol S, Aygencel TG, et al. Prediktorer for utfall hos pasienter med tuberkuløs meningitt. Det internasjonale tidsskriftet for tuberkulose og lungesykdom: det offisielle tidsskriftet til International Union against Tuberculosis and Lung Disease. 2002;6(1):64-70. PMID: 11931403
8. van Well GT, Paes BF, Terwee CB, Springer P, Roord JJ, Donald PR, et al. Tjue år med pediatrisk tuberkuløs meningitt: en retrospektiv kohortstudie i den vestlige kappen av Sør-Afrika. Pediatri. 2009;123(1):e1-8. doi: 10.1542/peds.2008-1353
9. Bahr NC, Marais S, Caws M, van Crevel R, Wilkinson RJ, Tyagi JS, et al. GeneXpert MTB/Rif for å diagnostisere tuberkuløs meningitt: Kanskje den første testen, men ikke den siste. Kliniske infeksjonssykdommer: en offisiell publikasjon av Infectious Diseases Society of America. 2016;62(9):1133-5. doi: 10.1093/cid/ciw083
10. Bahr NC, Nuwagira E, Evans EE, Cresswell FV, Bystrom PV, Byamukama A, et al. Diagnostisk nøyaktighet av Xpert MTB/RIF Ultra for tuberkuløs meningitt hos HIV-infiserte voksne: en prospektiv kohortstudie. The Lancet infeksjonssykdommer. 2018;18(1):68-75. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30474-7.
11. Marais SW, Wilkinson RJ. Diagnosen og medisinsk behandling av tuberkuløs meningitt hos voksne. South African Medical Journal. 2014;104(12). DOI:10.7196/SAMJ.9060
12. Solomons R, Grantham M, Marais BJ, van Toorn R. IMCI-indikatorer for TBM i barndom på primærhelsenivå i Western Cape-provinsen i Sør-Afrika. Det internasjonale tidsskriftet for tuberkulose og lungesykdom: det offisielle tidsskriftet til International Union against Tuberculosis and Lung Disease. 2016;20(10):1309-13. DOI: 10.5588/ijtld.16.0062
13. Bhigjee AI, Padayachee R, Paruk H, Hallwirth-Pillay KD, Marais S, Connoly C. Diagnose av tuberkuløs meningitt: kliniske og laboratorieparametere. Internasjonalt tidsskrift for infeksjonssykdommer: IJID: offisiell publikasjon av International Society for Infectious Diseases. 2007;11(4):348-54. DOI: 10.1016/j.ijid.2006.07.007
14. Marais S, Thwaites G, Schoeman JF, Torok ME, Misra UK, Prasad K, et al. Tuberkuløs meningitt: en enhetlig kasusdefinisjon for bruk i klinisk forskning. The Lancet infeksjonssykdommer. 2010;10(11):803-12. doi: 10.1016/S1473-3099(10)70138-9
15. Goenka A, Jeena PM, Mlisana K, Solomon T, Spicer K, Stephenson R, et al. Rask nøyaktig identifisering av tuberkuløs meningitt blant sørafrikanske barn ved hjelp av et nytt klinisk beslutningsverktøy. The Pediatric Infectious disease journal. 2018;37(3):229-34. DOI: 10.1097/INF.0000000000001726
16. Andronikou S, Wilmshurst J, Hatherill M, VanToorn R. Fordeling av hjerneinfarkt hos barn med tuberkuløs meningitt og korrelasjon med utfallsscore ved 6 måneder. Pediatrisk radiologi. 2006;36(12):1289-94. DOI: 10.1007/s00247-006-0319-7
17. Saitoh A, Pong A, Waecker NJ, Jr., Leake JA, Nespeca MP, Bradley JS. Prediksjon av nevrologiske følgetilstander i tuberkuløs meningitt i barndommen: en gjennomgang av 20 tilfeller og forslag til et nytt scoringssystem. The Pediatric Infectious disease journal. 2005;24(3):207-12. DOI: 10.1097/01.inf.0000154321.61866.2d
18. Verdens helseorganisasjon. Møterapport: Høyprioriterte målproduktprofiler for ny tuberkulosediagnostikk: rapport fra et konsensusmøte. Genève: Verdens helseorganisasjon; 28.–29. april 2014 2014.
19. Visser DH, Solomons RS, Ronacher K, van Well GT, Heymans MW, Walzl G, et al. Verts immunrespons på tuberkuløs meningitt. Kliniske infeksjonssykdommer: en offisiell publikasjon av Infectious Diseases Society of America. 2015;60(2):177-87. doi: 10.1093/cid/ciu781
20. Chegou NN, Sutherland JS, Malherbe S, Crampin AC, Corstjens PL, Geluk A, et al. Diagnostisk ytelse av en syv-markør serumproteinbiosignatur for diagnostisering av aktiv TB-sykdom i afrikanske primærhelseklinikkdeltakere med tegn og symptomer som tyder på TB. Brystkasse. 2016. Brystkasse. 2016;71(9):785-94. doi: 10.1136/thoraxjnl-2015-207999
21. Jacobs R, Malherbe S, Loxton AG, Stanley K, van der Spuy G, Walzl G, et al. Identifikasjon av nye vertsbiomarkører i plasma som kandidater for immundiagnose av tuberkulosesykdom og overvåking av tuberkulosebehandlingsrespons. Oncotarget. 2016;7(36):57581-92. doi: 10.18632/oncotarget.11420
22. Neveling DP, van den Heever TS, Perold WJ, Dicks LMT. En nanoforce ZnO nanowire-array biosensor for påvisning og kvantifisering av immunglobuliner. Sensorer og aktuatorer B. 2014;203:102-10. https://doi.org/10.1016/j.snb.2014.06.076
23. Maas MB, Maybery GHC, Perold WJ, Neveling DP, Dicks LMT. Borosilikatglass fiberoptisk biosensor for påvisning av Escherichia coli. Aktuell mikrobiologi. 2018;75(2):150-5. doi: 10.1007/s00284-017-1359-y.
24. Corstjens PL, Tjon Kon Fat EM, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Franken KL, Chegou NN, et al. Multisenterevaluering av en brukervennlig sidestrømsanalyse for å bestemme IP-10- og CCL4-nivåer i blod fra TB- og ikke-TB-tilfeller i Afrika. Klinisk biokjemi. 2016;49(1-2):22-31. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2015.08.013
25. Sutherland JS, Mendy J, Gindeh A, Walzl G, Togun T, Owolabi O, et al. Bruk av lateral flow-analyser for å bestemme IP-10- og CCL4-nivåer i pleurale effusjoner og fullblod for TB-diagnose. Tuberkulose (Edinburgh, Skottland). 2016;96:31-6. doi: 10.1016/j.tube.2015.10.011.
26. Marais BJ, Heemskerk AD, Marais SS, van Crevel R, Rohlwink U, Caws M, et al. Standardiserte metoder for forbedret kvalitet og sammenlignbarhet av studier av tuberkuløs meningitt. Kliniske infeksjonssykdommer: en offisiell publikasjon av Infectious Diseases Society of America. 2017;64(4):501-9. doi: 10.1093/cid/ciw757.
27. Kashyap RS, Dobos KM, Belisle JT, Purohit HJ, Chandak NH, Taori GM, et al. Demonstrasjon av komponenter av antigen 85-kompleks i cerebrospinalvæske hos pasienter med tuberkuløs meningitt. Klinisk og diagnostisk laboratorieimmunologi. 2005;12(6):752-8. DOI: 10.1128/CDLI.12.6.752-758.2005
28. du Preez K, Seddon JA, Schaaf HS, Hesseling AC, Starke JR, Osman M, et al. Global mangel på BCG-vaksine og tuberkuløs meningitt hos barn. The Lancet Global helse. 2019;7(1):e28-e9. DOI:10.1016/S2214-109X(18)30474-1