Valutazione di nuovi approcci basati su biomarcatori per migliorare la diagnosi della meningite tubercolare infantile (TBMBIOMARKER)

IMPORTANZA E RILEVANZA DELL'EDCTP2 Nonostante i notevoli sforzi in corso nello sviluppo di strumenti per combattere la tubercolosi (TB), la malattia è stata responsabile di circa 1,6 milioni di decessi, con 10 milioni di persone che hanno sviluppato la malattia in tutto il mondo nel 2017 (1). Si stima che un milione di bambini si sia ammalato di tubercolosi nel 2017 (1, 2). Otto paesi in Africa o in Asia, tra cui Sud Africa, Nigeria, India, Cina, Indonesia, Filippine, Pakistan e Bangladesh, rappresentano i due terzi del carico totale mondiale di tubercolosi (1). L'incidenza della tubercolosi in Sud Africa è passata da 301 nuovi casi/100.000 nel 1990 a 948/100.000 nel 2007 (3). Il peso della tubercolosi è aggravato dalla pandemia di HIV, che dilaga in Sud Africa e in altri paesi africani. La meningite tubercolare (TBM) è la forma più grave di tubercolosi, si manifesta principalmente durante la prima infanzia e presenta un'elevata morbilità e mortalità, a causa del ritardo nella diagnosi e nell'avvio di una terapia appropriata (4). La TBM è il tipo più comune di meningite batterica nella provincia del Capo Occidentale del Sud Africa (5).

Sono necessari nuovi test diagnostici TBM. Nonostante la ricerca in corso, mancano strumenti diagnostici precoci ed economici per la TBM (6). La rilevazione di Mycobacterium tuberculosis (Mtb) nel liquido cerebrospinale (CSF) è il gold standard per la diagnosi di TBM. Purtroppo la sensibilità sia della microscopia a striscio che della coltura per TBM è bassa (7, 8). A seconda dello standard di riferimento utilizzato, la sensibilità del test GeneXpert (Cepheid Inc, USA) per la TBM è di circa il 50-60% ed è migliorata fino al 72% quando in uno studio è stato utilizzato CSF ​​centrifugato (9). In uno studio pubblicato più di recente condotto su adulti sieropositivi, tuttavia, il GeneXpert ha ottenuto una sensibilità del 43% o del 45%, rispetto al 43% o al 45% per la coltura e al 70% o al 95% per il GeneXpert Ultra, a seconda di quale dei due standard di riferimento (10). Nonostante il lancio relativamente elevato del test GeneXpert in tutto il Sudafrica, il test è attualmente offerto principalmente presso laboratori centralizzati. La disponibilità del test in altri paesi africani è limitata. La diagnosi di tubercolosi si basa sullo screening dei sintomi scarsamente sensibile e sulla microscopia a striscio, specialmente nei centri sanitari rurali. Le strutture di coltura Mtb sono spesso disponibili solo presso i laboratori di riferimento e i risultati potrebbero richiedere fino a 42 giorni. La necessità di più visite sanitarie porta alla perdita di follow-up e diagnosi ritardate, alimentando la diffusione della tubercolosi e danni polmonari avanzati. Nel caso della TBM in particolare, una corretta diagnosi viene effettuata solo al momento del ricovero in un centro di riferimento di livello terziario. Nella pratica clinica di routine, la diagnosi si basa principalmente su una combinazione di risultati clinici, test di laboratorio multipli sul liquido cerebrospinale, risultati di imaging e l'esclusione di diagnosi differenziali comuni (11). La maggior parte di queste tecniche non è disponibile in molti contesti ad alto carico, ma con risorse limitate nella maggior parte dell'Africa subsahariana. I bambini visitati presso le strutture sanitarie primarie e secondarie spesso hanno molte occasioni perdute, fino a sei visite, prima che l'eventuale diagnosi di TBM venga effettuata in un ambiente relativamente ben attrezzato in Sud Africa (12). I risultati del CSF possono essere molto variabili (13). Recentemente, esperti internazionali hanno proposto nuove definizioni di casi uniformi che dovrebbero essere impiegate nella ricerca futura (14, 15) per sostituire le molte definizioni diverse in letteratura (7, 8, 13, 16, 17). Sono quindi urgentemente necessari nuovi test per la diagnosi di TBM.

Nell'Africa subsahariana sono necessari strumenti diagnostici point-of-care (POC) o al posto letto. Tutti i nuovi test per la TBM devono essere rapidi, facili da eseguire al POC o al capezzale e adatti per l'uso in contesti poveri di risorse nei paesi africani. Tali test dovrebbero, quindi, preferibilmente non utilizzare strumenti di laboratorio che richiedono specialisti per operare. Dovrebbero utilizzare dispositivi portatili a batteria o ad energia solare, adatti all'uso da parte di infermieri e operatori sanitari della comunità (18). La diagnostica basata sulla risposta immunitaria umana può fornire importanti aggiunte, che possono essere facilmente convertite in POC o strumenti diagnostici al posto letto.

Ospita firme proteiche CSF come candidati diagnostici per TBM. I ricercatori hanno studiato il potenziale dei marcatori dell'ospite rilevati nei campioni di CSF di bambini sospettati di avere TBM come candidati diagnostici per TBM (19). I ricercatori hanno valutato i livelli dei biomarcatori dell'ospite presenti in un kit standard di citochine multiplex BioPlex 27plex (Bio Rad Laboratories) e altri biomarcatori proteici nei campioni di CSF e siero. Un raggruppamento gerarchico senza supervisione e un'analisi dei componenti principali, utilizzando l'esploratore Glucore Omics, ha rivelato un significativo raggruppamento di pazienti con TBM dai biomarcatori rilevati nel CSF.

Una biofirma proteica dell'ospite a 3 marcatori comprendente il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), l'interleuchina (IL)-13 e il peptide antibatterico catelicidina, LL-37, ha mostrato il potenziale come biofirma diagnostica per la TBM (domanda di brevetto internazionale: PCT/IB2015/052751 ) (19), diagnosticando TBM con un'area sotto la curva delle caratteristiche dell'operatore ricevente (AUC) di 0,91, con una sensibilità del 52%, ma con una buona specificità del 95%. Dalla pubblicazione di questa firma biologica, i ricercatori hanno valutato il potenziale diagnostico di >70 biomarcatori dell'ospite in campioni di siero e plasma di adulti sospettati di avere una tubercolosi polmonare attiva in 5 diversi paesi africani (Sud Africa, Namibia, Malawi, Uganda ed Etiopia) in uno studio finanziato dall'EDCTP (AE-TBC). I ricercatori hanno identificato, brevettato (PCT/IB2015/051435 e PCT/IB2017/052142) e pubblicato firme biologiche proteiche a 6 e 7 marcatori con un forte potenziale diagnostico per la tubercolosi (20, 21).

In uno studio più recente (Domanda di brevetto provvisorio sudafricano; Manyelo et al 2019, in corso di stampa), i ricercatori hanno ipotizzato che almeno alcuni dei biomarcatori dell'ospite che comprendono le nostre firme biologiche delle proteine ​​adulte possano essere utili per la diagnostica della TBM. Finanziati dalla South African Technology Innovation Agency (PI: Chegou), i ricercatori hanno arruolato prospetticamente una nuova coorte di bambini sospettati di avere TBM presso il Tygerberg Academic Hospital, Western Cape, e hanno determinato le concentrazioni di 66 biomarcatori ospiti, in campioni di CSF da questi bambini. I ricercatori hanno anche incluso i 3 biomarcatori che comprendevano la nostra precedente biofirma CSF per TBM (VEGF, IL-13 e catelicidina LL-37) (19) per scopi di convalida in questo nuovo studio; un totale di 69 biomarcatori proteici dell'ospite.

Con l'eccezione di VEGF (AUC di 0,81), l'accuratezza dei singoli marcatori nella precedente firma a 3 marcatori era scarsa (AUC di 0,58 e 0,55, rispettivamente, per IL-13 e LL-37) ma quando usati in combinazione il la discriminazione tra TBM e no-TBM da parte del modello a 3 marcatori è stata confermata [AUC di 0,67 (IC 95%: 0,52-0,83); sensibilità del 75% e specificità del 65%]. Quarantasette dei marcatori aggiuntivi hanno mostrato differenze significative tra i gruppi TBM e senza TBM (test U di Mann Whitney), con 28 che hanno mostrato un forte potenziale diagnostico, anche come marcatori individuali (AUC ≥ 0,80). Questi marcatori includono interferone (IFN)-γ, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, mieloperossidasi (MPO), metalloproteinasi di matrice 9 (MMP) , MMP-8, complemento C2 (CC2), IL-10, inibitore totale dell'attivatore del plasminogeno 1 (PAI-1), CXCL8, IL-1β, alfa-2-antitripsina (A1AT), CXCL10, fattore stimolante le colonie di granulociti (G- CSF), CC4, CC4b, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF), fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF)-AB/BB, apolipoproteina A1 (apoA1), lectina legante il mannosio (MBL), ferritina, CC5a, amiloide sierica P (SAP) e CC5.

Le combinazioni di questi biomarcatori sono state studiate utilizzando modelli di analisi discriminante lineare (LDA). Una biofirma CSF a 4 marcatori comprendente una molecola di adesione intracellulare solubile (sICAM)-1, MPO, CXCL8 e IFN-γ TBM diagnosticata con un AUC di 0,97 (IC 95%: 0,92-1,00), con una sensibilità dell'87% (20/23) e una specificità del 95,8% (23/24). Dopo la validazione incrociata leave-one-out, non vi è stato alcun cambiamento nella sensibilità e nella specificità della firma biologica a 4 marcatori. Un'ulteriore ottimizzazione della firma biologica a 4 marcatori mediante la selezione di valori di cut-off migliori ha portato a una sensibilità e specificità rispettivamente del 96% e del 96%.

Poiché il VEGF si è comportato bene nelle analisi a singolo marcatore (19), i ricercatori hanno valutato la potenziale accuratezza di altre firme biologiche che includevano il VEGF. Un modello a 3 marcatori comprendente VEGF, IFN-γ e MPO ha discriminato con elevata precisione tra i bambini con e senza TBM. Nella validazione incrociata leave-one-out e nell'ottimizzazione dei migliori valori di cut-off, la sensibilità e la specificità della firma basata su VEGF a 3 marcatori erano rispettivamente del 92% e del 100%.

Firme della proteina ospite del siero come candidati diagnostici per TBM. Tutti i 69 marcatori ospiti studiati nei campioni di CSF sono stati studiati anche su campioni di siero utilizzando la piattaforma Luminex multiplex. I livelli sierici mediani di 17 analiti [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, adipsin, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( totale), PDGF AB/BB, MBL e NCAM1] erano significativamente differenti (p<0,05; Mann Whitney U test) tra bambini con e senza TBM. Quando il potenziale diagnostico dei singoli biomarcatori sierici è stato valutato mediante l'analisi della curva ROC, 13 dei marcatori avevano un AUC promettente ≥ 0,70. LDA ha dimostrato che la diagnosi ottimale di TBM è stata raggiunta utilizzando 3 marcatori. La biofirma sierica a 3 marcatori più accurata per la diagnosi di TBM [adipsina (fattore del complemento D), Ab42 e IL-10] ha diagnosticato TBM con un AUC di 0,84 (IC 95%: 0,73-0,96), una sensibilità dell'82,6% (19/23) e una specificità del 75% (18/24). Nella validazione incrociata leave-one-out, la sensibilità è rimasta dell'82,6% (19/23) con la specificità che è scesa al 70,3% (17/24). Un'ulteriore ottimizzazione della firma biologica mediante la selezione di migliori valori di cut-off ha portato a una migliore sensibilità e specificità rispettivamente dell'83% e dell'83%.

Piattaforma diagnostica basata su biosensori. I biomarcatori CSF e sierici con le migliori prestazioni per TBM saranno incorporati in una nuova piattaforma diagnostica POC da sviluppare presso la Facoltà di ingegneria, SU. I ricercatori hanno sviluppato un prototipo di sensore piezoelettrico utilizzando nanofili di ZnO, nonché un elemento di rilevamento resistivo basato su una rete di nanofibre elettrofilate (22). Il dispositivo ha rilevato con successo E. coli (23). I ricercatori hanno anche utilizzato questa tecnica per rilevare piccole quantità della proteina LC3, un biomarcatore per l'attività autofagica e, nell'ambito di un recente progetto di master, la piattaforma è stata in grado di rilevare IFN-γ, un biomarcatore chiave della TB negli intervalli fg/ml, dimostrando così la sua potenziale elevata sensibilità.

Utilizzeremo un approccio simile per sviluppare un test prototipo basato su multi-biomarcatori in grado di rilevare fino a 4 biomarcatori nel siero o nel liquido cerebrospinale e valutare prospetticamente il test su 300 bambini appena reclutati con sospetta TBM (Obiettivo 3).

OBIETTIVO GENERALE L'obiettivo principale è convalidare i biomarcatori del siero e del liquido cerebrospinale dell'ospite precedentemente identificati e sviluppare un test POC basato su biosensori per la diagnosi di TBM, sulla base di questi biomarcatori.

I ricercatori propongono di identificare un pannello di biomarcatori correlati che hanno mostrato potenzialità in studi precedenti. Questo sarà fatto per identificare i biomarcatori che possono essere sostituiti tra loro poiché la transizione da una piattaforma tecnologica basata su laboratorio come Luminex a un test POC che utilizza una tecnologia basata su biosensori rischia di essere affrontata dalla perdita di alcuni dei marcatori per motivi tecnici o per indisponibilità di alcuni marcatori a causa della proprietà degli anticorpi o di problemi di costo. Marcatori altamente correlati possono quindi sostituire tali marcatori. Gli investigatori testeranno quale set di biomarcatori funziona meglio nella piattaforma di test diagnostici POC. Infine, gli investigatori valuteranno prospetticamente il test del prototipo in una nuova coorte di 300 partecipanti allo studio con sospetta TBM come descritto di seguito.

Il test del prototipo si baserà sulla migliore biofirma di CSF o sui biomarcatori sierici, a seconda di quale si comporta meglio. Tuttavia, lo sviluppo del test basato sui biomarcatori sierici può essere vantaggioso poiché i campioni di CSF sono difficili da raccogliere. Inoltre, un test basato su biomarcatori sierici può essere facilmente convertito in un test basato sulla puntura del dito, che sarà molto più facile da implementare in contesti con risorse limitate. I ricercatori stanno attualmente valutando un test di screening del polpastrello per la tubercolosi adulta basato su biomarcatori dell'ospite scoperti e convalidati in campioni di siero come parte di un consorzio finanziato da EDCTP2 (www.screen-tb.eu).

Riferimenti

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