Ocena nowych metod opartych na biomarkerach w celu poprawy diagnostyki gruźliczego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u dzieci (TBMBIOMARKER)

ZNACZENIE I ZNACZENIE DLA EDCTP2 Pomimo znacznych ciągłych wysiłków w zakresie opracowywania narzędzi do zwalczania gruźlicy (TB), choroba ta była przyczyną około 1,6 miliona zgonów, przy czym w 2017 roku na całym świecie zachorowało na nią 10 milionów ludzi (1). Szacuje się, że w 2017 roku na gruźlicę zachorowało milion dzieci (1, 2). Osiem krajów w Afryce lub Azji, w tym RPA, Nigeria, Indie, Chiny, Indonezja, Filipiny, Pakistan i Bangladesz, odpowiada za dwie trzecie całkowitego światowego obciążenia gruźlicą (1). Zapadalność na gruźlicę w Afryce Południowej wzrosła z 301 nowych przypadków/100 000 w 1990 r. do 948/100 000 w 2007 r. (3). Obciążenie gruźlicą pogarsza pandemia HIV, która szerzy się w Afryce Południowej i innych krajach afrykańskich. Gruźlicze zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (TBM) jest najcięższą postacią gruźlicy, występuje głównie we wczesnym dzieciństwie i charakteryzuje się wysoką chorobowością i śmiertelnością z powodu opóźnionego rozpoznania i rozpoczęcia odpowiedniej terapii (4). TBM jest najczęstszym rodzajem bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych w prowincji Western Cape w Afryce Południowej (5).

Potrzebne są nowe testy diagnostyczne TBM. Pomimo trwających badań brakuje wczesnych i opłacalnych narzędzi diagnostycznych dla TBM (6). Wykrycie Mycobacterium tuberculosis (Mtb) w płynie mózgowo-rdzeniowym (PMR) jest złotym standardem w diagnostyce TBM. Niestety czułość zarówno mikroskopii rozmazowej, jak i hodowli w kierunku TBM jest niska (7, 8). W zależności od zastosowanego standardu referencyjnego, czułość testu GeneXpert (Cepheid Inc, USA) dla TBM wynosi około 50-60% i poprawiła się do 72%, gdy w jednym badaniu zastosowano odwirowany płyn mózgowo-rdzeniowy (9). Jednak w niedawno opublikowanym badaniu przeprowadzonym na osobach zakażonych wirusem HIV, GeneXpert działał z czułością 43% lub 45%, w porównaniu z 43% lub 45% dla hodowli i 70% lub 95% dla GeneXpert Ultra, w zależności od z dwóch wzorców odniesienia (10). Pomimo stosunkowo dużego rozpowszechnienia testu GeneXpert w Afryce Południowej, test ten jest obecnie oferowany głównie w scentralizowanych laboratoriach. Dostępność testu w innych krajach afrykańskich jest ograniczona. Rozpoznanie gruźlicy opiera się na słabo czułych badaniach przesiewowych objawów i mikroskopii rozmazowej, zwłaszcza w wiejskich ośrodkach zdrowia. Obiekty do hodowli Mtb są często dostępne tylko w laboratoriach referencyjnych, a wyniki mogą zająć do 42 dni. Konieczność wielokrotnych wizyt lekarskich prowadzi do utraty obserwacji i opóźnionej diagnozy, napędzając rozprzestrzenianie się gruźlicy i zaawansowane uszkodzenie płuc. W szczególności w przypadku TBM właściwe rozpoznanie stawiane jest dopiero po przyjęciu do ośrodka referencyjnego wyższego stopnia. W rutynowej praktyce klinicznej diagnoza opiera się głównie na połączeniu wyników klinicznych, wielu badań laboratoryjnych płynu mózgowo-rdzeniowego, wyników badań obrazowych i wykluczeniu typowych rozpoznań różnicowych (11). Większość z tych technik jest niedostępna w wielu obciążonych, ale ograniczonych zasobach miejscach w większości Afryki Subsaharyjskiej. Dzieci odwiedzane w placówkach podstawowej i specjalistycznej opieki zdrowotnej często mają wiele straconych szans, do sześciu wizyt, zanim zostanie postawiona ostateczna diagnoza TBM w stosunkowo dobrze wyposażonym środowisku w Afryce Południowej (12). Wyniki badania płynu mózgowo-rdzeniowego mogą być bardzo zmienne (13). Ostatnio międzynarodowi eksperci zaproponowali nowe jednolite definicje przypadków, które powinny być stosowane w przyszłych badaniach (14, 15), aby zastąpić wiele różnych definicji w literaturze (7, 8, 13, 16, 17). Dlatego pilnie potrzebne są nowe testy do diagnozy TBM.

W Afryce Subsaharyjskiej potrzebne są narzędzia diagnostyczne w miejscu opieki (POC) lub przyłóżkowe. Wszelkie nowe testy TBM muszą być szybkie, łatwe do wykonania w POC lub przy łóżku chorego i nadawać się do stosowania w warunkach ubogich w zasoby w krajach afrykańskich. Testy takie nie powinny zatem, najlepiej, odbywać się przy użyciu przyrządów laboratoryjnych, które wymagają specjalistów do obsługi. Powinni używać przenośnych urządzeń ręcznych zasilanych baterią lub energią słoneczną, odpowiednich dla pielęgniarek i pracowników służby zdrowia (18). Diagnostyka oparta na odpowiedzi immunologicznej człowieka może zapewnić ważne dodatki, które można łatwo przekształcić w narzędzia diagnostyczne POC lub przyłóżkowe.

Podpisy białkowe CSF gospodarza jako kandydaci diagnostyczni dla TBM. Badacze zbadali potencjał markerów gospodarza wykrytych w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego od dzieci podejrzanych o TBM jako kandydatów diagnostycznych na TBM (19). Badacze ocenili poziomy biomarkerów gospodarza obecnych w standardowym zestawie multipleksowym cytokin BioPlex 27plex (Bio Rad Laboratories) i innych biomarkerów białkowych w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego i surowicy. Nienadzorowana hierarchiczna analiza grupowania i analiza głównych składników, przy użyciu eksploratora Glucore Omics, ujawniła znaczące grupowanie pacjentów z TBM przez biomarkery wykryte w płynie mózgowo-rdzeniowym.

3-markerowa biosygnatura białka gospodarza, zawierająca czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), interleukinę (IL)-13 i przeciwbakteryjny peptyd katelicydynę, LL-37, wykazała potencjał jako biosygnatura diagnostyczna TBM (międzynarodowe zgłoszenie patentowe: PCT/IB2015/052751) ) (19), diagnozując TBM z polem pod krzywą charakterystyki operatora odbiornika (AUC) równym 0,91, z czułością 52%, ale z dobrą swoistością 95%. Od czasu opublikowania tej biosygnatury badacze ocenili potencjał diagnostyczny ponad 70 biomarkerów gospodarza w próbkach surowicy i osocza dorosłych podejrzanych o aktywną gruźlicę płuc w 5 różnych krajach afrykańskich (Republika Południowej Afryki, Namibia, Malawi, Uganda i Etiopia) w badanie finansowane przez EDCTP (AE-TBC). Badacze zidentyfikowali, opatentowali (PCT/IB2015/051435 i PCT/IB2017/052142) i opublikowali 6- i 7-markerowe biosygnatury białek o dużym potencjale diagnostycznym dla gruźlicy (20, 21).

W nowszym badaniu (zgłoszenie tymczasowego patentu południowoafrykańskiego; Manyelo i in. 2019, w druku) badacze postawili hipotezę, że przynajmniej niektóre biomarkery gospodarza zawierające nasze biosygnatury białek dorosłych mogą być przydatne w diagnostyce TBM. Finansowani przez Południowoafrykańską Agencję Innowacji Technologicznych (PI: Chegou), badacze prospektywnie zapisali nową kohortę dzieci podejrzanych o TBM w Szpitalu Akademickim Tygerberg w Western Cape i określili stężenia 66 biomarkerów gospodarza w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego z tych dzieci. Badacze uwzględnili również 3 biomarkery, które obejmowały naszą poprzednią biosygnaturę CSF dla TBM (VEGF, IL-13 i katelicydyna LL-37) (19) w celu walidacji w tym nowym badaniu; w sumie 69 biomarkerów białek gospodarza.

Z wyjątkiem VEGF (AUC 0,81), dokładność poszczególnych markerów w poprzedniej sygnaturze 3-markerowej była słaba (AUC odpowiednio 0,58 i 0,55, dla IL-13 i LL-37), ale w połączeniu potwierdzono dyskryminację między TBM i bez TBM w modelu z 3 znacznikami [AUC 0,67 (95% CI: 0,52-0,83); czułość 75% i specyficzność 65%]. Czterdzieści siedem dodatkowych markerów wykazało istotne różnice między grupami TBM i bez TBM (test U Manna Whitneya), przy czym 28 wykazywało silny potencjał diagnostyczny, nawet jako pojedyncze markery (AUC ≥ 0,80). Markery te obejmują interferon (IFN)-γ, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, czynnik martwicy nowotworów (TNF)-α, mieloperoksydaza (MPO), metaloproteinaza macierzy 9 (MMP) , MMP-8, dopełniacz C2 (CC2), IL-10, całkowity inhibitor aktywatora plazminogenu 1 (PAI-1), CXCL8, IL-1β, alfa-2-antytrypsyna (A1AT), CXCL10, czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G- CSF), CC4, CC4b, czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF)-AB/BB, apolipoproteina A1 (apoA1), lektyna wiążąca mannozę (MBL), ferrytyna, CC5a, surowiczy amyloid P (SAP) i CC5.

Zbadano kombinacje tych biomarkerów przy użyciu modeli liniowej analizy dyskryminacyjnej (LDA). 4-markerowy biosygnatura płynu mózgowo-rdzeniowego zawierająca rozpuszczalną wewnątrzkomórkową cząsteczkę adhezyjną (sICAM)-1, MPO, CXCL8 i IFN-γ zdiagnozowaną TBM z AUC 0,97 (95% CI: 0,92-1,00), z czułością 87% (20/23) i swoistością 95,8% (23/24). Po walidacji krzyżowej „pomiń jeden” nie nastąpiła zmiana w czułości i swoistości biosygnatury 4-markerowej. Dalsza optymalizacja biosygnatury 4-markerowej poprzez wybór lepszych wartości odcięcia dała czułość i swoistość odpowiednio 96% i 96%.

Ponieważ VEGF wypadł dobrze w analizach pojedynczych markerów (19), badacze ocenili potencjalną dokładność innych biosygnatur, które obejmowały VEGF. Model 3-markerowy zawierający VEGF, IFN-γ i MPO rozróżniał z dużą dokładnością dzieci z TBM i bez TBM. W walidacji krzyżowej i optymalizacji najlepszych wartości odcięcia czułość i swoistość 3-markerowej sygnatury opartej na VEGF wynosiły odpowiednio 92% i 100%.

Sygnatury białka gospodarza w surowicy jako kandydaci diagnostyczni dla TBM. Wszystkie 69 markerów gospodarza zbadanych w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego zbadano również w próbkach surowicy przy użyciu platformy multipleksowej Luminex. Mediana poziomów w surowicy 17 analitów [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, adypsyna, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( ogółem), PDGF AB/BB, MBL i NCAM1] były istotnie różne (p<0,05; test U Manna Whitneya) między dziećmi z TBM i bez TBM. Kiedy oceniono potencjał diagnostyczny poszczególnych biomarkerów surowicy za pomocą analizy krzywej ROC, 13 markerów miało obiecujące AUC ≥ 0,70. LDA wykazało, że optymalną diagnozę TBM osiągnięto przy użyciu 3 markerów. Najdokładniejsza biosygnatura 3-markerowa surowicy do diagnozy TBM [adipsyna (czynnik D dopełniacza), Ab42 i IL-10] zdiagnozowała TBM z AUC 0,84 (95% CI: 0,73-0,96), czułość 82,6% (19/23) i swoistość 75% (18/24). W walidacji krzyżowej typu „pomiń jedno wykluczone” czułość pozostała na poziomie 82,6% (19/23), a specyficzność spadła do 70,3% (17/24). Dalsza optymalizacja biosygnatury poprzez dobór lepszych wartości odcięcia zaowocowała poprawą czułości i specyficzności odpowiednio o 83% i 83%.

Platforma diagnostyczna oparta na biosensorach. Najlepiej działające biomarkery CSF i surowicy dla TBM zostaną włączone do nowej platformy diagnostycznej POC, która zostanie opracowana na Wydziale Inżynierii SU. Badacze opracowali prototypowy czujnik piezoelektryczny wykorzystujący nanoprzewody ZnO, a także rezystancyjny element czujnikowy oparty na elektroprzędzonej siatce nanowłókien (22). Urządzenie pomyślnie wykryło E. coli (23). Badacze wykorzystali również tę technikę do wykrycia niewielkich ilości białka LC3, biomarkera aktywności autofagii, a w ramach niedawnego projektu mistrzowskiego platforma była w stanie wykryć IFN-γ, kluczowy biomarker gruźlicy w zakresie fg/ml, demonstrując w ten sposób jego potencjalną wysoką czułość.

Zastosujemy podobne podejście do opracowania prototypowego testu opartego na wielu biomarkerach, który jest w stanie wykryć do 4 biomarkerów w surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym, i dokonamy prospektywnej oceny testu na 300 nowo zrekrutowanych dzieciach z podejrzeniem TBM (Cel 3).

CEL OGÓLNY Głównym celem jest walidacja wcześniej zidentyfikowanych biomarkerów surowicy gospodarza i płynu mózgowo-rdzeniowego oraz opracowanie opartego na bioczujnikach testu POC do diagnozowania TBM w oparciu o te biomarkery.

Badacze proponują zidentyfikowanie panelu skorelowanych biomarkerów, które wykazały potencjał w poprzednich badaniach. Zostanie to zrobione w celu zidentyfikowania biomarkerów, które można zastąpić sobą, ponieważ przejście z laboratoryjnej platformy technologicznej, takiej jak Luminex, do testu POC z wykorzystaniem technologii opartej na bioczujnikach może się wiązać z utratą niektórych markerów z przyczyn technicznych lub z powodu niedostępności niektórych markerów z powodu posiadania przeciwciał lub kwestii związanych z kosztami. Wysoce skorelowane markery mogą następnie zastąpić takie markery. Badacze sprawdzą, który zestaw biomarkerów działa najlepiej na platformie testów diagnostycznych POC. Na koniec badacze ocenią prospektywnie test prototypu w nowej kohorcie 300 uczestników badania z podejrzeniem TBM, jak opisano poniżej.

Test prototypu będzie oparty na najlepszej biosygnaturze biomarkerów płynu mózgowo-rdzeniowego lub surowicy, w zależności od tego, który z nich działa najlepiej. Jednak opracowanie testu w oparciu o biomarkery surowicy może być korzystne, ponieważ próbki płynu mózgowo-rdzeniowego są trudne do pobrania. Ponadto test oparty na biomarkerach surowicy można łatwo przekształcić w test oparty na nakłuciu palca, co będzie znacznie łatwiejsze do wdrożenia w warunkach ograniczonych zasobów. W ramach konsorcjum finansowanego przez EDCTP2 (www.screen-tb.eu) badacze oceniają obecnie test przesiewowy nakłucia palca w kierunku gruźlicy dorosłych w oparciu o biomarkery gospodarza wykryte i zweryfikowane w próbkach surowicy.

Bibliografia

1. Światowa Organizacja Zdrowia. Globalny raport dotyczący gruźlicy 2018.
2. Światowa Organizacja Zdrowia. Arkusz informacyjny dotyczący gruźlicy. 2018.
3. Światowa Organizacja Zdrowia. Globalna kontrola gruźlicy; Epidemiologia, strategia i finansowanie. Raport Światowej Organizacji Zdrowia 2009.
4. Schoeman J, Wait J, Burger M, van Zyl F, Fertig G, van Rensburg AJ i in. Długoterminowa obserwacja gruźliczego zapalenia opon mózgowych u dzieci. Medycyna rozwojowa i neurologia dziecięca. 2002;44(8):522-6. https://doi.org/10.1111/j.1469-8749.2002.tb00323.x
5. Donald PR, Cotton MF, Hendricks MK, Schaaf HS, de Villiers JN, Willemse TE. Pediatryczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych w prowincji Western Cape w Afryce Południowej. Journal of tropikalnej pediatrii. 1996;42(5):256-61. doi: 10.1093/tropej/42.5.256.
6. Thwaites GE, van Toorn R, Schoeman J. Gruźlicze zapalenie opon mózgowych: więcej pytań, wciąż za mało odpowiedzi. Neurologia Lanceta. 2013;12(10):999-1010. doi: 10.1016/S1474-4422(13)70168-6
7. Hosoglu S, Geyik MF, Balik I, Aygen B, Erol S, Aygencel TG i in. Predyktory wyniku u pacjentów z gruźliczym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych. Międzynarodowe czasopismo gruźlicy i chorób płuc: oficjalne czasopismo Międzynarodowej Unii przeciwko Gruźlicy i Chorobom Płuc. 2002;6(1):64-70. PMID: 11931403
8. van Well GT, Paes BF, Terwee CB, Springer P, Roord JJ, Donald PR i in. Dwadzieścia lat gruźliczego zapalenia opon mózgowych u dzieci: retrospektywne badanie kohortowe w zachodnim przylądku Republiki Południowej Afryki. Pediatria. 2009;123(1):e1-8. doi: 10.1542/peds.2008-1353
9. Bahr NC, Marais S, Caws M, van Crevel R, Wilkinson RJ, Tyagi JS i in. GeneXpert MTB/Rif do diagnozowania gruźliczego zapalenia opon mózgowych: być może pierwszy test, ale nie ostatni. Kliniczne choroby zakaźne: oficjalna publikacja Infectious Diseases Society of America. 2016;62(9):1133-5. doi: 10.1093/cid/ciw083
10. Bahr NC, Nuwagira E, Evans EE, Cresswell FV, Bystrom PV, Byamukama A i in. Dokładność diagnostyczna Xpert MTB/RIF Ultra w gruźliczym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych u osób dorosłych zakażonych wirusem HIV: prospektywne badanie kohortowe. Lancet Choroby zakaźne. 2018;18(1):68-75. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30474-7.
11. Marais SW, Wilkinson R J. Diagnoza i leczenie gruźliczego zapalenia opon mózgowych u dorosłych. Dziennik medyczny Republiki Południowej Afryki. 2014;104(12). DOI:10.7196/SAMJ.9060
12. Solomons R, Grantham M, Marais BJ, van Toorn R. Wskaźniki IMCI dziecięcej TBM na poziomie podstawowej opieki zdrowotnej w prowincji Western Cape w Afryce Południowej. Międzynarodowe czasopismo gruźlicy i chorób płuc: oficjalne czasopismo Międzynarodowej Unii przeciwko Gruźlicy i Chorobom Płuc. 2016;20(10):1309-13. DOI: 10.5588/ijtld.16.0062
13. Bhigjee AI, Padayachee R, Paruk H, Hallwirth-Pillay KD, Marais S, Connoly C. Rozpoznanie gruźliczego zapalenia opon mózgowych: parametry kliniczne i laboratoryjne. Międzynarodowy dziennik chorób zakaźnych: IJID: oficjalna publikacja Międzynarodowego Towarzystwa Chorób Zakaźnych. 2007;11(4):348-54. DOI: 10.1016/j.ijid.2006.07.007
14. Marais S, Thwaites G, Schoeman JF, Torok ME, Misra UK, Prasad K i in. Gruźlicze zapalenie opon mózgowych: jednolita definicja przypadku do stosowania w badaniach klinicznych. Lancet Choroby zakaźne. 2010;10(11):803-12. doi: 10.1016/S1473-3099(10)70138-9
15. Goenka A, Jeena PM, Mlisana K, Solomon T, Spicer K, Stephenson R i in. Szybka dokładna identyfikacja gruźliczego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych wśród południowoafrykańskich dzieci przy użyciu nowatorskiego narzędzia do podejmowania decyzji klinicznych. Dziennik chorób zakaźnych dzieci. 2018;37(3):229-34. DOI: 10.1097/INF.0000000000001726
16. Andronikou S, Wilmshurst J, Hatherill M, VanToorn R. Dystrybucja zawału mózgu u dzieci z gruźliczym zapaleniem opon mózgowych i korelacja z wynikiem wyniku po 6 miesiącach. Radiologia dziecięca. 2006;36(12):1289-94. DOI: 10.1007/s00247-006-0319-7
17. Saitoh A, Pong A, Waecker NJ, Jr., Leake JA, Nespeca MP, Bradley JS. Przewidywanie następstw neurologicznych w gruźliczym zapaleniu opon mózgowych u dzieci: przegląd 20 przypadków i propozycja nowego systemu punktacji. Dziennik chorób zakaźnych dzieci. 2005;24(3):207-12. DOI: 10.1097/01.inf.0000154321.61866.2d
18. Światowa Organizacja Zdrowia. Sprawozdanie ze spotkania: Profile produktów docelowych o wysokim priorytecie dla nowej diagnostyki gruźlicy: sprawozdanie ze spotkania konsensusowego. Genewa: Światowa Organizacja Zdrowia; 2014 28-29 kwietnia 2014.
19. Visser DH, Solomons RS, Ronacher K, van Well GT, Heymans MW, Walzl G i in. Odpowiedź immunologiczna gospodarza na gruźlicze zapalenie opon mózgowych. Kliniczne choroby zakaźne: oficjalna publikacja Infectious Diseases Society of America. 2015;60(2):177-87. doi: 10.1093/cid/ciu781
20. Chegou NN, Sutherland JS, Malherbe S, Crampin AC, Corstjens PL, Geluk A i in. Wydajność diagnostyczna siedmioznacznikowej biosygnatury białka surowicy do diagnozy aktywnej gruźlicy u uczestników afrykańskiej podstawowej opieki zdrowotnej z objawami przedmiotowymi i podmiotowymi sugerującymi gruźlicę. Tułów. 2016. Tułów. 2016;71(9):785-94. doi: 10.1136/thoraxjnl-2015-207999
21. Jacobs R, Malherbe S, Loxton AG, Stanley K, van der Spuy G, Walzl G, et al. Identyfikacja nowych biomarkerów gospodarza w osoczu jako kandydatów do immunodiagnostyki gruźlicy i monitorowania odpowiedzi na leczenie gruźlicy. Oncotarget. 2016;7(36):57581-92. doi: 10.18632/oncotarget.11420
22. Neveling DP, van den Heever TS, Perold WJ, Dicks LMT. Nanoforce ZnO biosensor z nanoprzewodami do wykrywania i ilościowego oznaczania immunoglobulin. Czujniki i siłowniki B. 2014;203:102-10. https://doi.org/10.1016/j.snb.2014.06.076
23. Maas MB, Maybery GHC, Perold WJ, Neveling DP, Dicks LMT. Bioczujnik światłowodowy ze szkła borokrzemianowego do wykrywania Escherichia coli. Aktualna mikrobiologia. 2018;75(2):150-5. doi: 10.1007/s00284-017-1359-y.
24. Corstjens PL, Tjon Kon Fat EM, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Franken KL, Chegou NN i in. Wieloośrodkowa ocena przyjaznego dla użytkownika testu przepływu bocznego w celu określenia poziomów IP-10 i CCL4 we krwi przypadków gruźlicy i innych niż gruźlica w Afryce. biochemia kliniczna. 2016;49(1-2):22-31. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2015.08.013
25. Sutherland JS, Mendy J, Gindeh A, Walzl G, Togun T, Owolabi O, et al. Wykorzystanie testów bocznego przepływu do oznaczania poziomów IP-10 i CCL4 w wysięku opłucnowym i pełnej krwi w diagnostyce gruźlicy. Gruźlica (Edynburg, Szkocja). 2016;96:31-6. doi: 10.1016/j.tube.2015.10.011.
26. Marais BJ, Heemskerk AD, Marais SS, van Crevel R, Rohlwink U, Caws M i in. Standaryzowane metody poprawy jakości i porównywalności badań gruźliczego zapalenia opon mózgowych. Kliniczne choroby zakaźne: oficjalna publikacja Infectious Diseases Society of America. 2017;64(4):501-9. doi: 10.1093/cid/ciw757.
27. Kashyap RS, Dobos KM, Belisle JT, Purohit HJ, Chandak NH, Taori GM i in. Wykazanie składników kompleksu antygenu 85 w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów z gruźliczym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych. Kliniczna i diagnostyczna immunologia laboratoryjna. 2005;12(6):752-8. DOI: 10.1128/CDLI.12.6.752-758.2005
28. du Preez K, Seddon JA, Schaaf HS, Hesseling AC, Starke JR, Osman M, et al. Światowe niedobory szczepionki BCG a gruźlicze zapalenie opon mózgowych u dzieci. Zdrowie Lancet Global. 2019;7(1):e28-e9. DOI:10.1016/S2214-109X(18)30474-1