Utvärdering av nya biomarkörbaserade tillvägagångssätt för att förbättra diagnosen av tuberkulös meningit hos barn (TBMBIOMARKER)

VIKT OCH RELEVANS FÖR EDCTP2 Trots betydande pågående ansträngningar för att utveckla verktyg för att bekämpa tuberkulos (TB) var sjukdomen ansvarig för cirka 1,6 miljoner dödsfall, med 10 miljoner människor som utvecklade sjukdomen världen över under 2017 (1). Uppskattningsvis en miljon barn insjuknade i tuberkulos 2017 (1, 2). Åtta länder i Afrika eller Asien, inklusive Sydafrika, Nigeria, Indien, Kina, Indonesien, Filippinerna, Pakistan och Bangladesh, stod för två tredjedelar av världens totala tuberkulosbörda (1). TBC-incidensen i Sydafrika steg från 301 nya fall/100 000 1990 till 948/100 000 2007 (3). TBC-bördan förvärras av HIV-pandemin, som är utbredd i Sydafrika och andra afrikanska länder. Tuberkulös meningit (TBM) är den allvarligaste formen av tuberkulos, förekommer mest under tidig barndom och har hög sjuklighet och mortalitet, på grund av försenad diagnos och initiering av lämplig behandling (4). TBM är den vanligaste typen av bakteriell meningit i Western Cape-provinsen i Sydafrika (5).

Nya TBM diagnostiska tester behövs. Trots pågående forskning saknas tidiga och kostnadseffektiva diagnostiska verktyg för TBM (6). Detektering av Mycobacterium tuberculosis (Mtb) i cerebrospinalvätska (CSF) är guldstandarden för att diagnostisera TBM. Tyvärr är känsligheten för både utstryksmikroskopi och kultur för TBM låg (7, 8). Beroende på vilken referensstandard som används är känsligheten hos GeneXpert-testet (Cepheid Inc, USA) för TBM cirka 50-60 % och förbättrades till 72 % när centrifugerad CSF användes i en studie (9). I en mer nyligen publicerad studie utförd på hiv-positiva vuxna presterade GeneXpert dock med en känslighet på 43 % eller 45 %, jämfört med 43 % eller 45 % för odling och 70 % eller 95 % för GeneXpert Ultra, beroende på vilken av de två referensstandarderna användes (10). Trots den relativt höga utrullningen av GeneXpert-testet i Sydafrika, erbjuds testet för närvarande mestadels vid centraliserade laboratorier. Tillgången till testet i andra afrikanska länder är begränsad. Diagnosen tuberkulos bygger på den dåligt känsliga symtomscreeningen och utstryksmikroskopi, särskilt på landsbygdens hälsocentraler. Mtb-odlingsanläggningar är ofta bara tillgängliga på remissnivålaboratorier och resultaten kan ta upp till 42 dagar. Behovet av flera vårdbesök leder till förlust av uppföljning och försenad diagnos, vilket underblåser spridningen av tuberkulos och avancerad lungskada. Särskilt när det gäller TBM ställs korrekt diagnos först vid inläggning på ett remisscenter på högre nivå. I rutinmässig klinisk praxis baseras diagnosen mestadels på en kombination av kliniska fynd, flera laboratorietester på CSF, avbildningsfynd och uteslutning av vanliga differentialdiagnoser (11). De flesta av dessa tekniker är otillgängliga i många högt belastade, men resursbegränsade miljöer i större delen av Afrika söder om Sahara. Barn som ses på primär- och sekundärvårdsinrättningar har ofta flera missade tillfällen, upp till sex besök, innan den slutliga diagnosen TBM ställs i en miljö med relativt goda resurser i Sydafrika (12). Fynden från CSF kan vara mycket varierande (13). Nyligen har internationella experter föreslagit nya enhetliga falldefinitioner som bör användas i framtida forskning (14, 15) för att ersätta de många olika definitionerna i litteraturen (7, 8, 13, 16, 17). Nya tester behövs därför akut för diagnostisering av TBM.

Point-of-care (POC) eller diagnostiska verktyg vid sängkanten behövs i Afrika söder om Sahara. Alla nya tester för TBM måste vara snabba, lätta att utföra vid POC eller vid sängen och lämpliga för användning i resurssvaga miljöer i afrikanska länder. Sådana tester bör därför helst inte använda laboratorieinstrument som kräver specialister för att operera. De bör använda bärbara batteri- eller solcellsdrivna handhållna enheter, lämpliga att användas av sjuksköterskor och hälsovårdspersonal (18). Diagnostik baserad på det mänskliga immunsvaret kan ge viktiga tillägg, som enkelt omvandlas till POC eller diagnostiska verktyg vid sängkanten.

Värd CSF-proteinsignaturer som diagnostiska kandidater för TBM. Utredarna undersökte potentialen hos värdmarkörer som upptäckts i CSF-prover från barn som misstänks ha TBM som diagnostiska kandidater för TBM (19). Utredarna utvärderade nivåerna av värdbiomarkörerna som finns i ett standard BioPlex 27plex multiplex cytokinkit (Bio Rad Laboratories) och andra proteinbiomarkörer i CSF och serumprover. En oövervakad hierarkisk klustring och analys av huvudkomponenter, med användning av Glucore Omics-utforskaren, avslöjade signifikant klustring av patienter med TBM av de biomarkörer som upptäckts i CSF.

En 3-markörs värdproteinbiosignatur innefattande vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF), interleukin (IL)-13 och den antibakteriella peptiden cathelicidin, LL-37, visade potential som en diagnostisk biosignatur för TBM (internationell patentansökan: PCT/IB2015/052751 ) (19), diagnostisera TBM med en area under mottagarens operatörsegenskaperskurva (AUC) på 0,91, med sensitivitet på 52 %, men med god specificitet på 95 %. Sedan publiceringen av denna biosignatur har utredarna utvärderat den diagnostiska potentialen för >70 värdbiomarkörer i serum- och plasmaprover från vuxna som misstänks ha aktiv lung-TB i 5 olika afrikanska länder (Sydafrika, Namibia, Malawi, Uganda och Etiopien) i en EDCTP-finansierad studie (AE-TBC). Utredarna identifierade, patenterade (PCT/IB2015/051435 och PCT/IB2017/052142) och publicerade 6- och 7-markörsproteinbiosignaturer med stark diagnostisk potential för TB (20, 21).

I en nyare studie (Sydafrikansk provisorisk patentansökan; Manyelo et al 2019, i press) antog utredarna att åtminstone några av värdbiomarkörerna som utgör våra biosignaturer för vuxna proteiner kan vara användbara för TBM-diagnostik. Finansieras av South African Technology Innovation Agency (PI: Chegou), registrerade utredarna prospektivt en ny kohort av barn som misstänks ha TBM vid Tygerberg Academic Hospital, Western Cape, och bestämde koncentrationerna av 66 värdbiomarkörer i CSF-prover från dessa barn. Utredarna inkluderade också de 3 biomarkörerna som utgjorde vår tidigare CSF-biosignatur för TBM (VEGF, IL-13 och cathelicidin LL-37) (19) för valideringsändamål i denna nya studie; totalt 69 värdproteinbiomarkörer.

Med undantag för VEGF (AUC på 0,81) var noggrannheten för de individuella markörerna i den tidigare 3-markörssignaturen dålig (AUC på 0,58 respektive 0,55 för IL-13 och LL-37) men när de används i kombination diskriminering mellan TBM och icke-TBM av 3-markörsmodellen bekräftades [AUC på 0,67 (95% KI: 0,52-0,83); sensitivitet på 75 % och specificitet på 65 %]. Fyrtiosju av de ytterligare markörerna visade signifikanta skillnader mellan TBM och inga TBM-grupper (Mann Whitney U-test), varav 28 visade stark diagnostisk potential, även som individuella markörer (AUC ≥ 0,80). Dessa markörer inkluderar interferon (IFN)-y, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, tumörnekrosfaktor (TNF)-α, myeloperoxidas (MPO), matrismetalloproteinas 9 (MMP) , MMP-8, komplement C2 (CC2), IL-10, total plasminogenaktivatorinhibitor 1 (PAI-1), CXCL8, IL-1β, alfa-2-antitrypsin(A1AT), CXCL10, granulocytkolonistimulerande faktor (G- CSF), CC4, CC4b, granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF), trombocythärledd tillväxtfaktor (PDGF)-AB/BB, apolipoprotein A1 (apoA1), mannosbindande lektin (MBL), ferritin, CC5a, serumamyloid P (SAP) och CC5.

Kombinationer av dessa biomarkörer undersöktes och med hjälp av linjär diskriminerande analys (LDA) modeller. En 4-markörs CSF-biosignatur innefattande löslig intracellulär adhesionsmolekyl (sICAM)-1, MPO, CXCL8 och IFN-y diagnostiserad TBM med en AUC på 0,97 (95 % CI: 0,92-1,00), med en sensitivitet på 87 % (20/23) och specificitet på 95,8 % (23/24). Efter en korsvalidering med utelämnande, fanns det ingen förändring i känsligheten och specificiteten för 4-markörens biosignatur. Ytterligare optimering av 4-markörens biosignatur genom val av bättre gränsvärden resulterade i en sensitivitet och specificitet på 96 % respektive 96 %.

Eftersom VEGF fungerade bra i singelmarkörsanalyser (19), utvärderade utredarna den potentiella noggrannheten hos andra biosignaturer som inkluderade VEGF. En 3-markörsmodell bestående av VEGF, IFN-γ och MPO särskiljde med hög noggrannhet mellan barnen med och utan TBM. I korsvalidering med utelämna en-ut och optimeringar av bästa cut-off-värden var känsligheten och specificiteten för den 3-markörs VEGF-baserade signaturen 92 % respektive 100 %.

Serumvärdproteinsignaturer som diagnostiska kandidater för TBM. Alla 69 värdmarkörer som undersöktes i CSF-prover undersöktes också på serumprover med Luminex multiplexplattform. Mediannivåerna i serum av 17 analyter [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, adipsin, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( totalt), PDGF AB/BB, MBL och NCAM1] var signifikant olika (p<0,05; Mann Whitney U-test) mellan barn med och utan TBM. När den diagnostiska potentialen för enskilda serumbiomarkörer bedömdes med ROC-kurvanalys hade 13 av markörerna lovande AUC ≥ 0,70. LDA visade att optimal diagnos av TBM uppnåddes med hjälp av 3 markörer. Den mest exakta 3-markörs serumbiosignaturen för diagnos av TBM [adipsin (komplementfaktor D), Ab42 och IL-10] diagnostiserade TBM med en AUC på 0,84 (95 % KI: 0,73-0,96), en sensitivitet på 82,6 % (19/23) och specificitet på 75 % (18/24). I korsvalidering med utelämna en-ut förblev sensitiviteten 82,6 % (19/23) och specificiteten minskade till 70,3 % (17/24). Ytterligare optimering av biosignaturen genom val av bättre gränsvärden resulterade i en förbättrad sensitivitet och specificitet på 83 % respektive 83 %.

Biosensorbaserad diagnostisk plattform. De bäst presterande CSF- och serumbiomarkörerna för TBM kommer att införlivas i en ny POC-diagnostisk plattform som ska utvecklas vid Tekniska fakulteten, SU. Utredarna har utvecklat en prototyp av piezoelektrisk sensor som använder ZnO nanotrådar, samt ett resistivt avkänningselement baserat på ett elektrospunnet nanofibernät (22). Enheten detekterade framgångsrikt E. coli (23). Utredarna har också använt denna teknik för att detektera små mängder av proteinet LC3, en biomarkör för autofagiaktivitet och som en del av ett nyligen masterprojekt kunde plattformen detektera IFN-γ, en viktig TB-biomarkör i fg/ml-intervall, visar därmed dess potentiella höga känslighet.

Vi kommer att använda ett liknande tillvägagångssätt för att utveckla ett multibiomarkörbaserat prototyptest som kan detektera upp till 4 biomarkörer i serum eller CSF, och prospektivt utvärdera testet på 300 nyrekryterade barn med misstänkt TBM (Mål 3).

ÖVERGRIPANDE MÅL Huvudsyftet är att validera tidigare identifierade värdserum och CSF-biomarkörer och att utveckla ett biosensorbaserat POC-test för diagnos av TBM, baserat på dessa biomarkörer.

Utredarna föreslår att identifiera en panel av korrelerade biomarkörer som visade potential i tidigare studier. Detta kommer att göras för att identifiera biomarkörer som kan ersättas med varandra eftersom övergången från en laboratoriebaserad teknisk plattform som Luminex till ett POC-test med en biosensorbaserad teknologi sannolikt kommer att stå inför förlusten av några av markörerna på grund av tekniska skäl eller på grund av att några av markörerna inte är tillgängliga på grund av antikroppsägande eller kostnadsproblem. Högkorrelerade markörer kan sedan ersätta sådana markörer. Utredarna kommer att testa vilken uppsättning biomarkörer som fungerar bäst i POC-diagnostiktestplattformen. Slutligen kommer utredarna att utvärdera prototyptestet prospektivt i en ny kohort av 300 studiedeltagare med misstänkt TBM enligt beskrivningen nedan.

Prototyptestet kommer att baseras på den bästa biosignaturen av CSF eller serumbiomarkörer, beroende på vilken som fungerar bäst. Att utveckla testet baserat på serumbiomarkörer kan dock vara fördelaktigt eftersom CSF-prover är svåra att samla in. Dessutom kan ett test baserat på serumbiomarkörer enkelt konverteras till ett fingersticksbaserat test, vilket kommer att vara mycket lättare att implementera i resursbegränsade miljöer. Utredarna utvärderar för närvarande ett fingersticksscreeningstest för vuxen TB baserat på värdbiomarkörer som upptäckts och validerats i serumprover som en del av ett EDCTP2-finansierat konsortium (www.screen-tb.eu).

Referenser

1. Världshälsoorganisationen. Global tuberkulosrapport 2018.
2. Världshälsoorganisationen. Faktablad om tuberkulos. 2018.
3. Världshälsoorganisationen. Global tuberkuloskontroll; Epidemiologi, strategi och finansiering. Världshälsoorganisationens rapport 2009.
4. Schoeman J, Wait J, Burger M, van Zyl F, Fertig G, van Rensburg AJ, et al. Långtidsuppföljning av tuberkulös meningit hos barn. Utvecklingsmedicin och barnneurologi. 2002;44(8):522-6. https://doi.org/10.1111/j.1469-8749.2002.tb00323.x
5. Donald PR, Cotton MF, Hendricks MK, Schaaf HS, de Villiers JN, Willemse TE. Pediatrisk meningit i Västra Kapprovinsen i Sydafrika. Journal of tropical pediatrics. 1996;42(5):256-61. doi: 10.1093/tropej/42.5.256.
6. Thwaites GE, van Toorn R, Schoeman J. Tuberkulös meningit: fler frågor, fortfarande för få svar. The Lancet Neurology. 2013;12(10):999-1010. doi: 10.1016/S1474-4422(13)70168-6
7. Hosoglu S, Geyik MF, Balik I, Aygen B, Erol S, Aygencel TG, et al. Prediktorer för utfall hos patienter med tuberkulös meningit. Den internationella tidskriften för tuberkulos och lungsjukdomar: den officiella tidningen för International Union against Tuberculosis and Lung Disease. 2002;6(1):64-70. PMID: 11931403
8. van Well GT, Paes BF, Terwee CB, Springer P, Roord JJ, Donald PR, et al. Tjugo år av pediatrisk tuberkulös meningit: en retrospektiv kohortstudie i västra udden av Sydafrika. Pediatrik. 2009;123(1):e1-8. doi: 10.1542/peds.2008-1353
9. Bahr NC, Marais S, Caws M, van Crevel R, Wilkinson RJ, Tyagi JS, et al. GeneXpert MTB/Rif för att diagnostisera tuberkulös meningit: Kanske det första testet men inte det sista. Kliniska infektionssjukdomar: en officiell publikation av Infectious Diseases Society of America. 2016;62(9):1133-5. doi: 10.1093/cid/ciw083
10. Bahr NC, Nuwagira E, Evans EE, Cresswell FV, Bystrom PV, Byamukama A, et al. Diagnostisk noggrannhet av Xpert MTB/RIF Ultra för tuberkulös meningit hos HIV-infekterade vuxna: en prospektiv kohortstudie. Lancets infektionssjukdomar. 2018;18(1):68-75. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30474-7.
11. Marais SW, Wilkinson R J. Diagnos och medicinsk hantering av tuberkulös meningit hos vuxna. Sydafrikansk medicinsk tidskrift. 2014;104(12). DOI:10.7196/SAMJ.9060
12. Solomons R, Grantham M, Marais BJ, van Toorn R. IMCI-indikatorer för TBM hos barn på primärvårdsnivå i Western Cape-provinsen i Sydafrika. Den internationella tidskriften för tuberkulos och lungsjukdomar: den officiella tidningen för International Union against Tuberculosis and Lung Disease. 2016;20(10):1309-13. DOI: 10.5588/ijtld.16.0062
13. Bhigjee AI, Padayachee R, Paruk H, Hallwirth-Pillay KD, Marais S, Connoly C. Diagnos av tuberkulös meningit: kliniska och laboratorieparametrar. Internationell tidskrift för infektionssjukdomar: IJID: officiell publikation av International Society for Infectious Diseases. 2007;11(4):348-54. DOI: 10.1016/j.ijid.2006.07.007
14. Marais S, Thwaites G, Schoeman JF, Torok ME, Misra UK, Prasad K, et al. Tuberkulös meningit: en enhetlig falldefinition för användning i klinisk forskning. Lancets infektionssjukdomar. 2010;10(11):803-12. doi: 10.1016/S1473-3099(10)70138-9
15. Goenka A, Jeena PM, Mlisana K, Solomon T, Spicer K, Stephenson R, et al. Snabb exakt identifiering av tuberkulös meningit bland sydafrikanska barn med hjälp av ett nytt kliniskt beslutsverktyg. The Pediatric Infectious Disease Journal. 2018;37(3):229-34. DOI: 10.1097/INF.0000000000001726
16. Andronikou S, Wilmshurst J, Hatherill M, VanToorn R. Fördelning av hjärninfarkt hos barn med tuberkulös meningit och korrelation med resultatpoäng efter 6 månader. Barnröntgen. 2006;36(12):1289-94. DOI: 10.1007/s00247-006-0319-7
17. Saitoh A, Pong A, Waecker NJ, Jr., Leake JA, Nespeca MP, Bradley JS. Förutsägelse av neurologiska följdsjukdomar i barndoms tuberkulös meningit: en översyn av 20 fall och förslag till ett nytt poängsystem. The Pediatric Infectious Disease Journal. 2005;24(3):207-12. DOI: 10.1097/01.inf.0000154321.61866.2d
18. Världshälsoorganisationen. Mötesrapport: Högprioriterade målproduktprofiler för ny tuberkulosdiagnostik: rapport från ett konsensusmöte. Genève: Världshälsoorganisationen; 2014 28-29 april 2014.
19. Visser DH, Solomons RS, Ronacher K, van Well GT, Heymans MW, Walzl G, et al. Värdens immunsvar mot tuberkulös meningit. Kliniska infektionssjukdomar: en officiell publikation av Infectious Diseases Society of America. 2015;60(2):177-87. doi: 10.1093/cid/ciu781
20. Chegou NN, Sutherland JS, Malherbe S, Crampin AC, Corstjens PL, Geluk A, et al. Diagnostisk prestanda av en biosignatur för sju-markörer av serumprotein för diagnos av aktiv TB-sjukdom hos deltagare i afrikanska primärvårdskliniker med tecken och symtom som tyder på TB. Bröstkorg. 2016. Bröstkorg. 2016;71(9):785-94. doi: 10.1136/thoraxjnl-2015-207999
21. Jacobs R, Malherbe S, Loxton AG, Stanley K, van der Spuy G, Walzl G, et al. Identifiering av nya värdbiomarkörer i plasma som kandidater för immundiagnos av tuberkulossjukdom och övervakning av tuberkulosbehandlingssvar. Oncotarget. 2016;7(36):57581-92. doi: 10.18632/oncotarget.11420
22. Neveling DP, van den Heever TS, Perold WJ, Dicks LMT. En nanoforce ZnO nanowire-array biosensor för detektion och kvantifiering av immunglobuliner. Sensorer och ställdon B. 2014;203:102-10. https://doi.org/10.1016/j.snb.2014.06.076
23. Maas MB, Maybery GHC, Perold WJ, Neveling DP, Dicks LMT. Borosilikatglasfiberoptisk biosensor för detektion av Escherichia coli. Aktuell mikrobiologi. 2018;75(2):150-5. doi: 10.1007/s00284-017-1359-y.
24. Corstjens PL, Tjon Kon Fat EM, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Franken KL, Chegou NN, et al. Multicenterutvärdering av en användarvänlig sidoflödesanalys för att bestämma IP-10- och CCL4-nivåer i blod av TB- och icke-TB-fall i Afrika. Klinisk biokemi. 2016;49(1-2):22-31. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2015.08.013
25. Sutherland JS, Mendy J, Gindeh A, Walzl G, Togun T, Owolabi O, et al. Användning av laterala flödesanalyser för att bestämma IP-10- och CCL4-nivåer i pleurautgjutning och helblod för TB-diagnos. Tuberkulos (Edinburgh, Skottland). 2016;96:31-6. doi: 10.1016/j.tube.2015.10.011.
26. Marais BJ, Heemskerk AD, Marais SS, van Crevel R, Rohlwink U, Caws M, et al. Standardiserade metoder för förbättrad kvalitet och jämförbarhet av studier av tuberkulös meningit. Kliniska infektionssjukdomar: en officiell publikation av Infectious Diseases Society of America. 2017;64(4):501-9. doi: 10.1093/cid/ciw757.
27. Kashyap RS, Dobos KM, Belisle JT, Purohit HJ, Chandak NH, Taori GM, et al. Demonstration av komponenter av antigen 85-komplex i cerebrospinalvätska hos patienter med tuberkulös meningit. Klinisk och diagnostisk laboratorieimmunologi. 2005;12(6):752-8. DOI: 10.1128/CDLI.12.6.752-758.2005
28. du Preez K, Seddon JA, Schaaf HS, Hesseling AC, Starke JR, Osman M, et al. Global brist på BCG-vaccin och tuberkulös meningit hos barn. The Lancet Global hälsa. 2019;7(1):e28-e9. DOI:10.1016/S2214-109X(18)30474-1