Evaluatie van nieuwe op biomarkers gebaseerde benaderingen voor het verbeteren van de diagnose van tuberculeuze meningitis bij kinderen (TBMBIOMARKER)

BELANG EN RELEVANTIE VOOR EDCTP2 Ondanks aanzienlijke voortdurende inspanningen in de ontwikkeling van middelen ter bestrijding van tuberculose (tbc), was de ziekte verantwoordelijk voor ongeveer 1,6 miljoen sterfgevallen, waarbij in 2017 wereldwijd 10 miljoen mensen de ziekte ontwikkelden (1). In 2017 werden naar schatting een miljoen kinderen tbc (1, 2). Acht landen in Afrika of Azië, waaronder Zuid-Afrika, Nigeria, India, China, Indonesië, de Filippijnen, Pakistan en Bangladesh, waren goed voor tweederde van de totale tbc-last in de wereld (1). De incidentie van tbc in Zuid-Afrika steeg van 301 nieuwe gevallen/100.000 in 1990 tot 948/100.000 in 2007 (3). De tbc-last wordt verergerd door de hiv-pandemie, die hoogtij viert in Zuid-Afrika en andere Afrikaanse landen. Tuberculeuze meningitis (TBM) is de meest ernstige vorm van tuberculose, komt meestal voor tijdens de vroege kinderjaren en heeft een hoge morbiditeit en mortaliteit als gevolg van de late diagnose en het starten van de juiste therapie (4). TBM is het meest voorkomende type bacteriële meningitis in de provincie West-Kaap in Zuid-Afrika (5).

Er zijn nieuwe TBM-diagnostische tests nodig. Ondanks lopend onderzoek ontbreken vroege en kosteneffectieve diagnostische hulpmiddelen voor TBM (6). De detectie van Mycobacterium tuberculosis (Mtb) in cerebrospinale vloeistof (CSF) is de gouden standaard voor de diagnose van TBM. Helaas is de gevoeligheid van zowel uitstrijkmicroscopie als kweek voor TBM laag (7, 8). Afhankelijk van de gebruikte referentiestandaard is de gevoeligheid van de GeneXpert-test (Cepheid Inc, VS) voor TBM ongeveer 50-60%, en verbeterd tot 72% wanneer gecentrifugeerd CSF werd gebruikt in één onderzoek (9). In een recenter gepubliceerd onderzoek onder hiv-positieve volwassenen presteerde de GeneXpert echter met een gevoeligheid van 43% of 45%, vergeleken met 43% of 45% voor kweek en 70% of 95% voor de GeneXpert Ultra, afhankelijk van welke van de twee referentiestandaarden werden gebruikt (10). Ondanks de relatief hoge uitrol van de GeneXpert-test in heel Zuid-Afrika, wordt de test momenteel grotendeels aangeboden in gecentraliseerde laboratoria. De beschikbaarheid van de test in andere Afrikaanse landen is beperkt. De diagnose van tuberculose is afhankelijk van de slecht gevoelige symptoomscreening en uitstrijkjesmicroscopie, vooral in gezondheidscentra op het platteland. Mtb-kweekfaciliteiten zijn vaak alleen beschikbaar in laboratoria op verwijzingsniveau en de resultaten kunnen tot 42 dagen op zich laten wachten. De behoefte aan meerdere bezoeken aan de gezondheidszorg leidt tot verlies van follow-up en vertraagde diagnose, wat de verspreiding van tbc en vergevorderde longschade aanwakkert. Met name in het geval van TBM wordt de juiste diagnose pas gesteld bij opname in een verwijzingscentrum op tertiair niveau. In de routinematige klinische praktijk is de diagnose meestal gebaseerd op een combinatie van klinische bevindingen, meerdere laboratoriumtesten op het CSF, beeldvormende bevindingen en het uitsluiten van veelvoorkomende differentiaaldiagnoses (11). De meeste van deze technieken zijn niet beschikbaar in veel zwaarbelaste, maar beperkte middelen in het grootste deel van Afrika bezuiden de Sahara. Kinderen die in eerstelijns- en tweedelijnsgezondheidszorginstellingen worden gezien, hebben vaak meerdere gemiste kansen, tot zes bezoeken, voordat de uiteindelijke diagnose van TBM wordt gesteld in een relatief goed uitgeruste omgeving in Zuid-Afrika (12). Bevindingen van het CSF kunnen zeer variabel zijn (13). Onlangs hebben internationale experts nieuwe uniforme casusdefinities voorgesteld die in toekomstig onderzoek zouden moeten worden gebruikt (14, 15) ter vervanging van de vele verschillende definities in de literatuur (7, 8, 13, 16, 17). Nieuwe testen zijn daarom dringend nodig voor de diagnose TBM.

Point-of-care (POC) of diagnostische hulpmiddelen aan het bed zijn nodig in Sub-Sahara Afrika. Alle nieuwe tests voor TBM moeten snel zijn, gemakkelijk uit te voeren op de POC of aan het bed, en geschikt voor gebruik in arme omgevingen in Afrikaanse landen. Dergelijke tests zouden daarom bij voorkeur geen laboratoriuminstrumenten moeten gebruiken die door specialisten moeten worden bediend. Ze moeten draagbare op batterijen of zonne-energie werkende handapparaten gebruiken die geschikt zijn voor gebruik door verpleegkundigen en gezondheidswerkers in de gemeenschap (18). Diagnostiek op basis van de menselijke immuunrespons kan belangrijke aanvullingen opleveren, die eenvoudig kunnen worden omgezet in POC- of bedside diagnostic tools.

Host CSF-eiwithandtekeningen als diagnostische kandidaten voor TBM. De onderzoekers onderzochten het potentieel van gastheermarkers die werden gedetecteerd in CSF-monsters van kinderen waarvan wordt vermoed dat ze TBM hebben als diagnostische kandidaten voor TBM (19). De onderzoekers evalueerden de niveaus van de gastheerbiomarkers die aanwezig zijn in een standaard BioPlex 27plex multiplex cytokinekit (Bio Rad Laboratories) en andere eiwitbiomarkers in CSF- en serummonsters. Een ongecontroleerde hiërarchische clustering en analyse van hoofdcomponenten, met behulp van de Glucore Omics-verkenner, onthulde een significante clustering van patiënten met TBM door de biomarkers die in de CSF werden gedetecteerd.

Een 3-marker biosignatuur van het gastheereiwit bestaande uit vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), interleukine (IL)-13 en het antibacteriële peptide cathelicidine, LL-37, toonde potentieel als diagnostische biosignatuur voor TBM (internationale octrooiaanvraag: PCT/IB2015/052751 ) (19), waarbij TBM werd gediagnosticeerd met een gebied onder de curve van de receiver-operatorkarakteristieken (AUC) van 0,91, met een gevoeligheid van 52%, maar met een goede specificiteit van 95%. Sinds de publicatie van deze biosignatuur hebben de onderzoekers het diagnostisch potentieel geëvalueerd van >70 gastheerbiomarkers in serum- en plasmamonsters van volwassenen die verdacht worden van actieve longtuberculose in 5 verschillende Afrikaanse landen (Zuid-Afrika, Namibië, Malawi, Oeganda en Ethiopië) in een door EDCTP gefinancierde studie (AE-TBC). De onderzoekers identificeerden, patenteerden (PCT/IB2015/051435 en PCT/IB2017/052142) en publiceerden 6- en 7-marker eiwitbiosignaturen met een sterk diagnostisch potentieel voor tuberculose (20, 21).

In een recentere studie (Zuid-Afrikaanse voorlopige octrooiaanvraag; Manyelo et al 2019, in druk), veronderstelden de onderzoekers dat ten minste enkele van de biomarkers van de gastheer waaruit onze biosignaturen van volwassen eiwitten bestaan, nuttig kunnen zijn voor TBM-diagnostiek. Gefinancierd door het Zuid-Afrikaanse Technology Innovation Agency (PI: Chegou), namen de onderzoekers prospectief een nieuw cohort kinderen op waarvan wordt vermoed dat ze TBM hebben in het Tygerberg Academic Hospital, Western Cape, en bepaalden de concentraties van 66 biomarkers van de gastheer, in CSF-monsters van deze kinderen. De onderzoekers namen ook de 3 biomarkers op die onze eerdere CSF-biosignatuur voor TBM (VEGF, IL-13 en cathelicidine LL-37) (19) vormden voor validatiedoeleinden in deze nieuwe studie; in totaal 69 biomarkers voor gastheereiwitten.

Met uitzondering van VEGF (AUC van 0,81) was de nauwkeurigheid van de individuele markers in de vorige handtekening met 3 markeringen slecht (AUC's van respectievelijk 0,58 en 0,55 voor IL-13 en LL-37), maar bij gebruik in combinatie discriminatie tussen TBM en geen-TBM door het 3-markermodel werd bevestigd [AUC van 0,67 (95% CI: 0,52-0,83); sensitiviteit van 75% en specificiteit van 65%]. Zevenenveertig van de aanvullende markers vertoonden significante verschillen tussen de TBM- en geen TBM-groepen (Mann Whitney U-test), waarbij 28 een sterk diagnostisch potentieel vertoonden, zelfs als individuele markers (AUC ≥ 0,80). Deze markers omvatten interferon (IFN)-γ, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, tumornecrosefactor (TNF)-α, myeloperoxidase (MPO), matrixmetalloproteïnase 9 (MMP) , MMP-8, complement C2 (CC2), IL-10, totale plasminogeenactivatorremmer 1 (PAI-1), CXCL8, IL-1β, alfa-2-antitrypsine (A1AT), CXCL10, granulocytkoloniestimulerende factor (G- CSF), CC4, CC4b, granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF), van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF)-AB/BB, apolipoproteïne A1 (apoA1), mannose-bindend lectine (MBL), ferritine, CC5a, serumamyloïde P (SAP) en CC5.

Combinaties van deze biomarkers werden onderzocht met behulp van Linear Discriminant Analysis (LDA)-modellen. Een 4-marker CSF-biosignatuur bestaande uit oplosbaar intracellulair adhesiemolecuul (sICAM)-1, MPO, CXCL8 en IFN-γ gediagnosticeerde TBM met een AUC van 0,97 (95% BI: 0,92-1,00), met een sensitiviteit van 87% (20/23) en specificiteit van 95,8% (23/24). Na een kruisvalidatie zonder weglating was er geen verandering in de sensitiviteit en specificiteit van de 4-marker biosignatuur. Verdere optimalisatie van de 4-marker biosignatuur door de selectie van betere afkapwaarden resulteerde in een sensitiviteit en specificiteit van respectievelijk 96% en 96%.

Aangezien VEGF goed presteerde in single-marker-analyses (19), evalueerden de onderzoekers de potentiële nauwkeurigheid van andere biosignaturen waaronder VEGF. Een 3-markermodel bestaande uit VEGF, IFN-γ en MPO discrimineerde met hoge nauwkeurigheid tussen de kinderen met en zonder TBM. Bij weggelaten kruisvalidatie en optimalisatie van de beste afkapwaarden waren de gevoeligheid en specificiteit van de op VEGF gebaseerde signatuur met 3 markeringen respectievelijk 92% en 100%.

Serum-gastheereiwitsignaturen als diagnostische kandidaten voor TBM. Alle 69 gastheermarkers die in CSF-monsters werden onderzocht, werden ook onderzocht op serummonsters met behulp van het Luminex multiplex-platform. De mediane serumspiegels van 17 analyten [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, adipsin, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( totaal), PDGF AB/BB, MBL en NCAM1] waren significant verschillend (p<0,05; Mann Whitney U-test) tussen kinderen met en zonder TBM. Toen het diagnostisch potentieel van individuele serumbiomarkers werd beoordeeld door middel van ROC-curveanalyse, hadden 13 van de markers een veelbelovende AUC ≥ 0,70. LDA toonde aan dat een optimale diagnose van TBM werd bereikt met behulp van 3 markers. De meest nauwkeurige 3-marker serumbiosignatuur voor de diagnose van TBM [adipsine (complementfactor D), Ab42 en IL-10] diagnosticeerde TBM met een AUC van 0,84 (95% CI: 0,73-0,96), een sensitiviteit van 82,6% (19/23) en specificiteit van 75% (18/24). In de leave-one-out kruisvalidatie bleef de sensitiviteit 82,6% (19/23) terwijl de specificiteit afnam tot 70,3% (17/24). Verdere optimalisatie van de biosignatuur door selectie van betere afkapwaarden resulteerde in een verbeterde sensitiviteit en specificiteit van respectievelijk 83% en 83%.

Biosensor-gebaseerd diagnostisch platform. De best presterende CSF- en serumbiomarkers voor TBM zullen worden opgenomen in een nieuw POC-diagnostisch platform dat zal worden ontwikkeld aan de Engineering Faculty, SU. De onderzoekers hebben een prototype van een piëzo-elektrische sensor ontwikkeld met behulp van ZnO-nanodraden, evenals een resistief detectie-element op basis van een elektrogesponnen nanovezelgaas (22). Het apparaat heeft met succes E. coli gedetecteerd (23). De onderzoekers hebben deze techniek ook gebruikt om kleine hoeveelheden van het eiwit LC3 te detecteren, een biomarker voor autofagie-activiteit. waarmee de potentiële hoge gevoeligheid wordt aangetoond.

We zullen een vergelijkbare aanpak gebruiken om een ​​op multi-biomarkers gebaseerde prototypetest te ontwikkelen die tot 4 biomarkers in serum of CSF kan detecteren, en de test prospectief evalueren op 300 nieuw aangeworven kinderen met verdenking op TBM (doel 3).

ALGEMENE DOELSTELLING Het hoofddoel is het valideren van eerder geïdentificeerde gastheerserum- en CSF-biomarkers en het ontwikkelen van een op biosensoren gebaseerde POC-test voor de diagnose van TBM, op ​​basis van deze biomarkers.

De onderzoekers stellen voor om een ​​panel van gecorreleerde biomarkers te identificeren die potentieel toonden in eerdere studies. Dit zal worden gedaan om biomarkers te identificeren die door elkaar kunnen worden vervangen, aangezien de overgang van een laboratoriumgebaseerd technologisch platform zoals Luminex naar een POC-test met behulp van een op biosensor gebaseerde technologie waarschijnlijk zal worden geconfronteerd met het verlies van enkele van de markers vanwege technische redenen of vanwege onbeschikbaarheid van sommige markers vanwege eigendom van antilichamen of kosten. Sterk gecorreleerde merkers kunnen dergelijke merkers dan vervangen. De onderzoekers gaan testen welke set biomarkers het beste werkt in het POC diagnostisch testplatform. Ten slotte zullen de onderzoekers de prototypetest prospectief evalueren in een nieuw cohort van 300 studiedeelnemers met verdenking op TBM, zoals hieronder beschreven.

De prototypetest zal gebaseerd zijn op de beste biosignatuur van CSF- of serumbiomarkers, afhankelijk van welke het beste presteert. Het ontwikkelen van de test op basis van serumbiomarkers kan echter voordelig zijn, omdat CSF-monsters moeilijk te verzamelen zijn. Bovendien kan een test op basis van serumbiomarkers eenvoudig worden omgezet in een op vingerprik gebaseerde test, die veel gemakkelijker te implementeren zal zijn in omgevingen met beperkte middelen. De onderzoekers evalueren momenteel een vingerprikscreeningstest voor tbc bij volwassenen op basis van gastheerbiomarkers die zijn ontdekt en gevalideerd in serummonsters als onderdeel van een door EDCTP2 gefinancierd consortium (www.screen-tb.eu).

Referenties

1. Wereld Gezondheid Organisatie. Wereldwijd tuberculoserapport 2018.
2. Wereld Gezondheid Organisatie. Informatieblad over tuberculose. 2018.
3. Wereld Gezondheid Organisatie. Wereldwijde tuberculosebestrijding; Epidemiologie, Strategie en Financiering. Rapport van de Wereldgezondheidsorganisatie 2009.
4. Schoeman J, Wait J, Burger M, van Zyl F, Fertig G, van Rensburg AJ, et al. Langdurige follow-up van tuberculeuze meningitis bij kinderen. Ontwikkelingsgeneeskunde en kinderneurologie. 2002;44(8):522-6. https://doi.org/10.1111/j.1469-8749.2002.tb00323.x
5. Donald PR, Cotton MF, Hendricks MK, Schaaf HS, de Villiers JN, Willemse TE. Pediatrische meningitis in de provincie West-Kaap in Zuid-Afrika. Tijdschrift voor tropische kindergeneeskunde. 1996;42(5):256-61. doi: 10.1093/tropej/42.5.256.
6. Thwaites GE, van Toorn R, Schoeman J. Tuberculeuze meningitis: meer vragen, nog steeds te weinig antwoorden. De Lancet Neurologie. 2013;12(10):999-1010. doi: 10.1016/S1474-4422(13)70168-6
7. Hosoglu S, Geyik MF, Balik I, Aygen B, Erol S, Aygencel TG, et al. Voorspellers van uitkomst bij patiënten met tuberculeuze meningitis. Het internationale tijdschrift voor tuberculose en longziekte: het officiële tijdschrift van de Internationale Unie tegen tuberculose en longziekte. 2002;6(1):64-70. PMID: 11931403
8. van Well GT, Paes BF, Terwee CB, Springer P, Roord JJ, Donald PR, et al. Twintig jaar pediatrische tuberculeuze meningitis: een retrospectieve cohortstudie in de westkaap van Zuid-Afrika. Kindergeneeskunde. 2009;123(1):e1-8. doi: 10.1542/peds.2008-1353
9. Bahr NC, Marais S, Caws M, van Crevel R, Wilkinson RJ, Tyagi JS, et al. GeneXpert MTB/Rif om tuberculeuze meningitis te diagnosticeren: misschien de eerste test, maar niet de laatste. Klinische infectieziekten: een officiële publicatie van de Infectious Diseases Society of America. 2016;62(9):1133-5. doi: 10.1093/cid/ciw083
10. Bahr NC, Nuwagira E, Evans EE, Cresswell FV, Bystrom PV, Byamukama A, et al. Diagnostische nauwkeurigheid van Xpert MTB/RIF Ultra voor tuberculeuze meningitis bij met hiv geïnfecteerde volwassenen: een prospectieve cohortstudie. The Lancet Infectieziekten. 2018;18(1):68-75. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30474-7.
11. Marais SW, Wilkinson R J. De diagnose en medische behandeling van tuberculeuze meningitis bij volwassenen. Zuid-Afrikaans medisch tijdschrift. 2014;104(12). DOI:10.7196/SAMJ.9060
12. Solomons R, Grantham M, Marais BJ, van Toorn R. IMCI-indicatoren van TBM bij kinderen op het niveau van de eerstelijnsgezondheidszorg in de provincie West-Kaap in Zuid-Afrika. Het internationale tijdschrift voor tuberculose en longziekte: het officiële tijdschrift van de Internationale Unie tegen tuberculose en longziekte. 2016;20(10):1309-13. DOI: 10.5588/ijtld.16.0062
13. Bhigjee AI, Padayachee R, Paruk H, Hallwirth-Pillay KD, Marais S, Connoly C. Diagnose van tuberculeuze meningitis: klinische en laboratoriumparameters. Internationaal tijdschrift voor infectieziekten: IJID: officiële publicatie van de International Society for Infectious Diseases. 2007;11(4):348-54. DOI: 10.1016/j.ijid.2006.07.007
14. Marais S, Thwaites G, Schoeman JF, Torok ME, Misra UK, Prasad K, et al. Tuberculeuze meningitis: een uniforme gevalsdefinitie voor gebruik in klinisch onderzoek. The Lancet Infectieziekten. 2010;10(11):803-12. doi: 10.1016/S1473-3099(10)70138-9
15. Goenka A, Jeena PM, Mlisana K, Solomon T, Spicer K, Stephenson R, et al. Snelle nauwkeurige identificatie van tuberculeuze meningitis bij Zuid-Afrikaanse kinderen met behulp van een nieuw klinisch beslissingsinstrument. Het pediatrische tijdschrift voor infectieziekten. 2018;37(3):229-34. DOI: 10.1097/INF.0000000000001726
16. Andronikou S, Wilmshurst J, Hatherill M, VanToorn R. Verdeling van herseninfarct bij kinderen met tuberculeuze meningitis en correlatie met uitkomstscore na 6 maanden. Kinderradiologie. 2006;36(12):1289-94. DOI: 10.1007/s00247-006-0319-7
17. Saitoh A, Pong A, Waecker NJ, Jr., Leake JA, Nespeca MP, Bradley JS. Voorspelling van neurologische gevolgen bij tuberculeuze meningitis bij kinderen: een overzicht van 20 gevallen en een voorstel voor een nieuw scoresysteem. Het pediatrische tijdschrift voor infectieziekten. 2005;24(3):207-12. DOI: 10.1097/01.inf.0000154321.61866.2d
18. Wereld Gezondheid Organisatie. Verslag van bijeenkomst: Doelproductprofielen met hoge prioriteit voor nieuwe tuberculosediagnostiek: verslag van een consensusbijeenkomst. Genève: Wereldgezondheidsorganisatie; 2014 28-29 april 2014.
19. Visser DH, Solomons RS, Ronacher K, van Well GT, Heymans MW, Walzl G, et al. Gastheer immuunrespons op tuberculeuze meningitis. Klinische infectieziekten: een officiële publicatie van de Infectious Diseases Society of America. 2015;60(2):177-87. doi: 10.1093/cid/ciu781
20. Chegou NN, Sutherland JS, Malherbe S, Crampin AC, Corstjens PL, Geluk A, et al. Diagnostische prestaties van een zeven-marker serumproteïne-biosignatuur voor de diagnose van actieve tbc-ziekte bij bezoekers van Afrikaanse eerstelijnsgezondheidsklinieken met tekenen en symptomen die wijzen op tbc. Thorax. 2016. Thorax. 2016;71(9):785-94. doi: 10.1136/thoraxjnl-2015-207999
21. Jacobs R, Malherbe S, Loxton AG, Stanley K, van der Spuy G, Walzl G, et al. Identificatie van nieuwe gastheerbiomarkers in plasma als kandidaten voor de immunodiagnose van de ziekte van tuberculose en monitoring van de respons op de behandeling van tuberculose. Oncotarget. 2016;7(36):57581-92. doi: 10.18632/oncotarget.11420
22. Neveling DP, van den Heever TS, Perold WJ, Dicks LMT. Een nanoforce ZnO nanowire-array biosensor voor de detectie en kwantificering van immunoglobulinen. Sensoren en actuatoren B. 2014;203:102-10. https://doi.org/10.1016/j.snb.2014.06.076
23. Maas MB, Mayery GHC, Perold WJ, Neveling DP, Dicks LMT. Borosilicaatglasvezel-optische biosensor voor de detectie van Escherichia coli. Huidige microbiologie. 2018;75(2):150-5. doi: 10.1007/s00284-017-1359-y.
24. Corstjens PL, Tjon Kon Fat EM, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Franken KL, Chegou NN, et al. Multi-center evaluatie van een gebruiksvriendelijke laterale flow-assay om IP-10- en CCL4-waarden in het bloed van tbc- en niet-tbc-gevallen in Afrika te bepalen. Klinische biochemie. 2016;49(1-2):22-31. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2015.08.013
25. Sutherland JS, Mendy J, Gindeh A, Walzl G, Togun T, Owolabi O, et al. Gebruik van laterale flow-assays om IP-10- en CCL4-niveaus te bepalen in pleurale effusies en volbloed voor de diagnose van tuberculose. Tuberculose (Edinburgh, Schotland). 2016;96:31-6. doi: 10.1016/j.tube.2015.10.011.
26. Marais BJ, Heemskerk AD, Marais SS, van Crevel R, Rohlwink U, Caws M, et al. Gestandaardiseerde methoden voor verbeterde kwaliteit en vergelijkbaarheid van onderzoeken naar tuberculeuze meningitis. Klinische infectieziekten: een officiële publicatie van de Infectious Diseases Society of America. 2017;64(4):501-9. doi: 10.1093/cid/ciw757.
27. Kashyap RS, Dobos KM, Belisle JT, Purohit HJ, Chandak NH, Taori GM, et al. Demonstratie van componenten van antigeen 85-complex in hersenvocht van patiënten met tuberculeuze meningitis. Klinische en diagnostische laboratoriumimmunologie. 2005;12(6):752-8. DOI: 10.1128/CDLI.12.6.752-758.2005
28. du Preez K, Seddon JA, Schaaf HS, Hesseling AC, Starke JR, Osman M, et al. Wereldwijde tekorten aan BCG-vaccin en tuberculeuze meningitis bij kinderen. The Lancet Wereldwijde gezondheid. 2019;7(1):e28-e9. DOI:10.1016/S2214-109X(18)30474-1