Évaluation de nouvelles approches basées sur les biomarqueurs pour améliorer le diagnostic de la méningite tuberculeuse de l'enfant (TBMBIOMARKER)

IMPORTANCE ET PERTINENCE POUR L'EDCTP2 Malgré des efforts continus considérables dans le développement d'outils de lutte contre la tuberculose (TB), la maladie a été responsable d'environ 1,6 million de décès, et 10 millions de personnes ont développé la maladie dans le monde en 2017 (1). On estime qu'un million d'enfants ont contracté la tuberculose en 2017 (1, 2). Huit pays d'Afrique ou d'Asie, dont l'Afrique du Sud, le Nigéria, l'Inde, la Chine, l'Indonésie, les Philippines, le Pakistan et le Bangladesh, représentaient les deux tiers de la charge mondiale totale de tuberculose (1). L'incidence de la tuberculose en Afrique du Sud est passée de 301 nouveaux cas/100 000 en 1990 à 948/100 000 en 2007 (3). Le fardeau de la tuberculose est aggravé par la pandémie de VIH, qui sévit en Afrique du Sud et dans d'autres pays africains. La méningite tuberculeuse (TBM) est la forme la plus grave de tuberculose, survient principalement pendant la petite enfance et a une morbidité et une mortalité élevées, en raison du diagnostic tardif et de l'initiation d'un traitement approprié (4). La TBM est le type de méningite bactérienne le plus courant dans la province du Cap occidental en Afrique du Sud (5).

De nouveaux tests de diagnostic TBM sont nécessaires. Malgré les recherches en cours, des outils de diagnostic précoces et rentables pour le TBM font défaut (6). La détection de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) est l'étalon-or pour le diagnostic de TBM. Malheureusement, la sensibilité de la microscopie de frottis et de la culture pour la TBM est faible (7, 8). Selon l'étalon de référence utilisé, la sensibilité du test GeneXpert (Cepheid Inc, États-Unis) pour le TBM est d'environ 50 à 60 % et s'améliore à 72 % lorsque le LCR centrifugé a été utilisé dans une étude (9). Dans une étude publiée plus récemment et menée sur des adultes séropositifs, cependant, le GeneXpert a fonctionné avec une sensibilité de 43 % ou 45 %, contre 43 % ou 45 % pour la culture et 70 % ou 95 % pour le GeneXpert Ultra, selon le cas. des deux étalons de référence ont été utilisés (10). Malgré le déploiement relativement élevé du test GeneXpert en Afrique du Sud, le test est actuellement principalement proposé dans des laboratoires centralisés. La disponibilité du test dans d'autres pays africains est limitée. Le diagnostic de la tuberculose repose sur le dépistage peu sensible des symptômes et l'examen microscopique des frottis, en particulier dans les centres de santé ruraux. Les installations de culture de Mtb ne sont souvent disponibles que dans les laboratoires de référence et les résultats peuvent prendre jusqu'à 42 jours. La nécessité de multiples visites de soins de santé entraîne une perte de suivi et un retard de diagnostic, alimentant la propagation de la tuberculose et des lésions pulmonaires avancées. Dans le cas de la MTB en particulier, un diagnostic correct n'est posé qu'à l'admission dans un centre de référence de niveau tertiaire. Dans la pratique clinique de routine, le diagnostic repose principalement sur une combinaison de résultats cliniques, de multiples tests de laboratoire sur le LCR, des résultats d'imagerie et l'exclusion des diagnostics différentiels courants (11). La plupart de ces techniques ne sont pas disponibles dans de nombreux contextes à charge élevée mais à ressources limitées dans la majeure partie de l'Afrique subsaharienne. Les enfants vus dans les établissements de soins de santé primaires et secondaires ont souvent de multiples occasions manquées, jusqu'à six visites, avant qu'un éventuel diagnostic de TBM ne soit posé dans un cadre relativement bien doté en Afrique du Sud (12). Les résultats du CSF peuvent être très variables (13). Récemment, des experts internationaux ont proposé de nouvelles définitions de cas uniformes qui devraient être utilisées dans les recherches futures (14, 15) pour remplacer les nombreuses définitions différentes dans la littérature (7, 8, 13, 16, 17). De nouveaux tests sont donc nécessaires de toute urgence pour le diagnostic de TBM.

Des outils de diagnostic au point de service (POC) ou au chevet du patient sont nécessaires en Afrique subsaharienne. Tout nouveau test de TBM doit être rapide, facile à réaliser au point de contact ou au chevet du patient et adapté à une utilisation dans les pays africains aux ressources limitées. De tels tests devraient donc de préférence ne pas utiliser d'instruments de laboratoire qui nécessitent des spécialistes pour fonctionner. Ils doivent utiliser des appareils portables à piles ou à énergie solaire, adaptés à l'utilisation par les infirmières et les agents de santé communautaires (18). Les diagnostics basés sur la réponse immunitaire humaine peuvent fournir des ajouts importants, qui sont facilement convertis en POC ou en outils de diagnostic au chevet du patient.

Signatures de protéines hôtes CSF comme candidats diagnostiques pour TBM. Les enquêteurs ont étudié le potentiel des marqueurs hôtes détectés dans les échantillons de LCR d'enfants suspectés d'avoir TBM comme candidats diagnostiques pour TBM (19). Les enquêteurs ont évalué les niveaux des biomarqueurs de l'hôte présents dans un kit de cytokine multiplex BioPlex 27plex standard (Bio Rad Laboratories) et d'autres biomarqueurs protéiques dans les échantillons de LCR et de sérum. Un regroupement hiérarchique non supervisé et une analyse en composantes principales, à l'aide de l'explorateur Glucore Omics, ont révélé un regroupement significatif de patients atteints de TBM par les biomarqueurs détectés dans le LCR.

Une biosignature de protéine hôte à 3 marqueurs comprenant le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), l'interleukine (IL)-13 et le peptide antibactérien cathélicidine, LL-37, a montré un potentiel en tant que biosignature diagnostique pour le TBM (demande de brevet internationale : PCT/IB2015/052751 ) (19), diagnostiquant TBM avec une aire sous la courbe des caractéristiques de l'opérateur du récepteur (AUC) de 0,91, avec une sensibilité de 52 %, mais avec une bonne spécificité de 95 %. Depuis la publication de cette biosignature, les chercheurs ont évalué le potentiel diagnostique de plus de 70 biomarqueurs hôtes dans des échantillons de sérum et de plasma d'adultes suspectés d'avoir une tuberculose pulmonaire active dans 5 pays africains différents (Afrique du Sud, Namibie, Malawi, Ouganda et Éthiopie) en un essai financé par l'EDCTP (AE-TBC). Les chercheurs ont identifié, breveté (PCT/IB2015/051435 et PCT/IB2017/052142) et publié des biosignatures protéiques à 6 et 7 marqueurs à fort potentiel diagnostique pour la tuberculose (20, 21).

Dans une étude plus récente (demande de brevet provisoire sud-africain ; Manyelo et al 2019, sous presse), les chercheurs ont émis l'hypothèse qu'au moins certains des biomarqueurs hôtes comprenant nos biosignatures protéiques adultes pourraient être utiles pour le diagnostic du TBM. Financés par l'Agence sud-africaine d'innovation technologique (PI : Chegou), les enquêteurs ont recruté de manière prospective une nouvelle cohorte d'enfants suspectés d'être atteints de TBM à l'hôpital universitaire de Tygerberg, dans le Cap occidental, et ont déterminé les concentrations de 66 biomarqueurs hôtes dans des échantillons de LCR de ces enfants. Les chercheurs ont également inclus les 3 biomarqueurs qui composaient notre précédente biosignature du LCR pour le TBM (VEGF, IL-13 et cathélicidine LL-37) (19) à des fins de validation dans cette nouvelle étude ; un total de 69 biomarqueurs de protéines hôtes.

À l'exception du VEGF (ASC de 0,81), la précision des marqueurs individuels dans la signature à 3 marqueurs précédente était médiocre (ASC de 0,58 et 0,55, respectivement, pour l'IL-13 et la LL-37), mais lorsqu'ils sont utilisés en combinaison, le la discrimination entre TBM et non-TBM par le modèle à 3 marqueurs a été confirmée [ASC de 0,67 (IC 95 % : 0,52-0,83) ; sensibilité de 75% et spécificité de 65%]. Quarante-sept des marqueurs supplémentaires ont montré des différences significatives entre les groupes TBM et sans TBM (test U de Mann Whitney), 28 montrant un fort potentiel diagnostique, même en tant que marqueurs individuels (AUC ≥ 0,80). Ces marqueurs comprennent l'interféron (IFN)-γ, CCL18(MIP-4), CXCL9, CCL1, CCL5(RANTES), IL-6, le facteur de nécrose tumorale (TNF)-α, la myéloperoxydase (MPO), la métalloprotéinase matricielle 9 (MMP) , MMP-8, complément C2 (CC2), IL-10, inhibiteur total de l'activateur du plasminogène 1 (PAI-1), CXCL8, IL-1β, alpha-2-antitrypsine (A1AT), CXCL10, facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G- CSF), CC4, CC4b, facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF), facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF)-AB/BB, apolipoprotéine A1 (apoA1), lectine liant le mannose (MBL), ferritine, CC5a, amyloïde P sérique (SAP) et CC5.

Des combinaisons de ces biomarqueurs ont été étudiées à l'aide de modèles d'analyse discriminante linéaire (ADL). Une biosignature de LCR à 4 marqueurs comprenant une molécule d'adhésion intracellulaire soluble (sICAM)-1, MPO, CXCL8 et IFN-γ a diagnostiqué un TBM avec une ASC de 0,97 (IC à 95 % : 0,92-1,00), avec une sensibilité de 87 % (20/23) et une spécificité de 95,8 % (23/24). Après validation croisée leave-one-out, il n'y a eu aucun changement dans la sensibilité et la spécificité de la biosignature à 4 marqueurs. Une optimisation supplémentaire de la biosignature à 4 marqueurs par la sélection de meilleures valeurs seuil a entraîné une sensibilité et une spécificité de 96 % et 96 %, respectivement.

Comme le VEGF s'est bien comporté dans les analyses à marqueur unique (19), les chercheurs ont évalué la précision potentielle d'autres biosignatures incluant le VEGF. Un modèle à 3 marqueurs comprenant VEGF, IFN-γ et MPO a discriminé avec une grande précision entre les enfants avec et sans TBM. Dans la validation croisée leave-one-out et les optimisations des meilleures valeurs seuils, la sensibilité et la spécificité de la signature basée sur le VEGF à 3 marqueurs étaient de 92 % et 100 %, respectivement.

Signatures protéiques de l'hôte sérique en tant que candidats diagnostiques pour TBM. Les 69 marqueurs hôtes étudiés dans les échantillons de LCR ont également été étudiés sur des échantillons de sérum à l'aide de la plateforme multiplex Luminex. Les taux sériques médians de 17 analytes [sVCAM1, CCL2, IL-4, TNF-α, CCL4, adipsine, SAP, CC5, CFH, G-CSF, IL-10, Apo-CIII, IL-17A, PAI-1( total), PDGF AB/BB, MBL et NCAM1] étaient significativement différents (p<0,05 ; Mann Whitney U test) entre enfants avec et sans TBM. Lorsque le potentiel diagnostique des biomarqueurs sériques individuels a été évalué par analyse de la courbe ROC, 13 des marqueurs avaient une ASC prometteuse ≥ 0,70. LDA a démontré que le diagnostic optimal de TBM a été atteint en utilisant 3 marqueurs. La biosignature sérique à 3 marqueurs la plus précise pour le diagnostic de TBM [adipsine (facteur D du complément), Ab42 et IL-10] a diagnostiqué un TBM avec une ASC de 0,84 (IC à 95 % : 0,73-0,96), une sensibilité de 82,6 % (19/23) et une spécificité de 75 % (18/24). Dans la validation croisée leave-one-out, la sensibilité est restée à 82,6 % (19/23) avec une spécificité diminuant à 70,3 % (17/24). Une optimisation supplémentaire de la biosignature par la sélection de meilleures valeurs seuil a entraîné une amélioration de la sensibilité et de la spécificité de 83 % et 83 %, respectivement.

Plateforme de diagnostic basée sur les biocapteurs. Les biomarqueurs les plus performants du LCR et du sérum pour le TBM seront intégrés dans une nouvelle plate-forme de diagnostic POC qui sera développée à la Faculté d'ingénierie, SU. Les chercheurs ont développé un prototype de capteur piézoélectrique utilisant des nanofils de ZnO, ainsi qu'un élément de détection résistif basé sur un maillage de nanofibres électrofilées (22). L'appareil a détecté avec succès E. coli (23). Les chercheurs ont également utilisé cette technique pour détecter de petites quantités de la protéine LC3, un biomarqueur de l'activité d'autophagie et dans le cadre d'un récent projet de maîtrise, la plateforme était capable de détecter l'IFN-γ, un biomarqueur clé de la tuberculose dans les gammes fg/ml, démontrant ainsi sa grande sensibilité potentielle.

Nous utiliserons une approche similaire pour développer un test prototype basé sur plusieurs biomarqueurs capable de détecter jusqu'à 4 biomarqueurs dans le sérum ou le LCR, et évaluerons prospectivement le test sur 300 enfants nouvellement recrutés avec une suspicion de TBM (Objectif 3).

OBJECTIF GLOBAL L'objectif principal est de valider les biomarqueurs du sérum de l'hôte et du LCR précédemment identifiés et de développer un test POC basé sur des biocapteurs pour le diagnostic de la TBM, basé sur ces biomarqueurs.

Les chercheurs proposent d'identifier un panel de biomarqueurs corrélés qui ont montré un potentiel dans les études précédentes. Cela sera fait pour identifier des biomarqueurs qui peuvent être substitués les uns aux autres, car la transition d'une plate-forme technologique en laboratoire telle que Luminex vers un test POC utilisant une technologie basée sur des biocapteurs risque d'être confrontée à la perte de certains des marqueurs. pour des raisons techniques ou en raison de l'indisponibilité de certains des marqueurs en raison de la propriété des anticorps ou de problèmes de coût. Des marqueurs hautement corrélés peuvent alors remplacer ces marqueurs. Les chercheurs testeront quel ensemble de biomarqueurs fonctionne le mieux dans la plateforme de tests de diagnostic POC. Enfin, les enquêteurs évalueront le test prototype de manière prospective dans une nouvelle cohorte de 300 participants à l'étude suspectés de TBM, comme décrit ci-dessous.

Le test prototype sera basé sur la meilleure biosignature du LCR ou des biomarqueurs sériques, selon celui qui fonctionne le mieux. Cependant, développer le test basé sur des biomarqueurs sériques peut être avantageux car les échantillons de LCR sont difficiles à collecter. De plus, un test basé sur des biomarqueurs sériques peut être facilement converti en un test basé sur une piqûre au doigt, qui sera beaucoup plus facile à mettre en œuvre dans des contextes à ressources limitées. Les chercheurs évaluent actuellement un test de dépistage par piqûre au doigt pour la tuberculose adulte basé sur des biomarqueurs hôtes découverts et validés dans des échantillons de sérum dans le cadre d'un consortium financé par l'EDCTP2 (www.screen-tb.eu).

Références

1. Organisation mondiale de la santé. Rapport mondial sur la tuberculose 2018.
2. Organisation mondiale de la santé. Fiche d'information sur la tuberculose. 2018.
3. Organisation mondiale de la santé. lutte mondiale contre la tuberculose ; Epidémiologie, Stratégie et Financement. Rapport 2009 de l'Organisation mondiale de la santé.
4. Schoeman J, Wait J, Burger M, van Zyl F, Fertig G, van Rensburg AJ, et al. Suivi à long terme de la méningite tuberculeuse de l'enfant. Médecine du développement et neurologie de l'enfant. 2002;44(8):522-6. https://doi.org/10.1111/j.1469-8749.2002.tb00323.x
5. Donald PR, Cotton MF, Hendricks MK, Schaaf HS, de Villiers JN, Willemse TE. Méningite pédiatrique dans la province du Cap occidental en Afrique du Sud. Journal de pédiatrie tropicale. 1996;42(5):256-61. doi : 10.1093/tropej/42.5.256.
6. Thwaites GE, van Toorn R, Schoeman J. Méningite tuberculeuse : plus de questions, encore trop peu de réponses. La Neurologie du Lancet. 2013;12(10):999-1010. doi : 10.1016/S1474-4422(13)70168-6
7. Hosoglu S, Geyik MF, Balik I, Aygen B, Erol S, Aygencel TG, et al. Prédicteurs de résultats chez les patients atteints de méningite tuberculeuse. Le journal international de la tuberculose et des maladies pulmonaires : le journal officiel de l'Union internationale contre la tuberculose et les maladies respiratoires. 2002;6(1):64-70. PMID : 11931403
8. van Well GT, Paes BF, Terwee CB, Springer P, Roord JJ, Donald PR, et al. Vingt ans de méningite tuberculeuse pédiatrique: une étude de cohorte rétrospective dans le cap occidental de l'Afrique du Sud. Pédiatrie. 2009;123(1):e1-8. doi : 10.1542/peds.2008-1353
9. Bahr NC, Marais S, Caws M, van Crevel R, Wilkinson RJ, Tyagi JS, et al. GeneXpert MTB/Rif pour diagnostiquer la méningite tuberculeuse : peut-être le premier test mais pas le dernier. Maladies infectieuses cliniques : une publication officielle de l'Infectious Diseases Society of America. 2016;62(9):1133-5. doi : 10.1093/cid/ciw083
10. Bahr NC, Nuwagira E, Evans EE, Cresswell FV, Bystrom PV, Byamukama A, et al. Précision diagnostique de Xpert MTB/RIF Ultra pour la méningite tuberculeuse chez les adultes infectés par le VIH : une étude de cohorte prospective. Les maladies infectieuses du Lancet. 2018;18(1):68-75. doi : 10.1016/S1473-3099(17)30474-7.
11. Marais SW, Wilkinson R J. Le diagnostic et la prise en charge médicale de la méningite tuberculeuse chez l'adulte. Journal médical sud-africain. 2014;104(12). DOI:10.7196/SAMJ.9060
12. Solomons R, Grantham M, Marais BJ, van Toorn R. Indicateurs PCIME de TBM infantile au niveau des soins de santé primaires dans la province du Cap occidental en Afrique du Sud. Le journal international de la tuberculose et des maladies pulmonaires : le journal officiel de l'Union internationale contre la tuberculose et les maladies respiratoires. 2016;20(10):1309-13. DOI : 10.5588/ijtld.16.0062
13. Bhigjee AI, Padayachee R, Paruk H, Hallwirth-Pillay KD, Marais S, Connoly C. Diagnostic de la méningite tuberculeuse : paramètres cliniques et de laboratoire. Revue internationale des maladies infectieuses : IJID : publication officielle de la Société internationale des maladies infectieuses. 2007;11(4):348-54. DOI : 10.1016/j.ijid.2006.07.007
14. Marais S, Thwaites G, Schoeman JF, Torok ME, Misra UK, Prasad K, et al. Méningite tuberculeuse : une définition de cas uniforme à utiliser en recherche clinique. Les maladies infectieuses du Lancet. 2010;10(11):803-12. doi : 10.1016/S1473-3099(10)70138-9
15. Goenka A, Jeena PM, Mlisana K, Solomon T, Spicer K, Stephenson R, et al. Identification rapide et précise de la méningite tuberculeuse chez les enfants sud-africains à l'aide d'un nouvel outil de décision clinique. Le journal des maladies infectieuses pédiatriques. 2018;37(3):229-34. DOI : 10.1097/INF.0000000000001726
16. Andronikou S, Wilmshurst J, Hatherill M, VanToorn R. Distribution de l'infarctus cérébral chez les enfants atteints de méningite tuberculeuse et corrélation avec le résultat à 6 mois. Radiologie pédiatrique. 2006;36(12):1289-94. DOI : 10.1007/s00247-006-0319-7
17. Saitoh A, Pong A, Waecker NJ, Jr., Leake JA, Nespeca MP, Bradley JS. Prédiction des séquelles neurologiques dans la méningite tuberculeuse de l'enfant : revue de 20 cas et proposition d'un nouveau système de notation. Le journal des maladies infectieuses pédiatriques. 2005;24(3):207-12. DOI : 10.1097/01.inf.0000154321.61866.2d
18. Organisation mondiale de la santé. Rapport de réunion : Profils de produits cibles hautement prioritaires pour les nouveaux diagnostics de la tuberculose : rapport d'une réunion de consensus. Genève : Organisation mondiale de la santé ; 2014 28-29 avril 2014.
19. Visser DH, Solomons RS, Ronacher K, van Well GT, Heymans MW, Walzl G, et al. Réponse immunitaire de l'hôte à la méningite tuberculeuse. Maladies infectieuses cliniques : une publication officielle de l'Infectious Diseases Society of America. 2015;60(2):177-87. doi: 10.1093/cid/ciu781
20. Chegou NN, Sutherland JS, Malherbe S, Crampin AC, Corstjens PL, Geluk A, et al. Performance diagnostique d'une biosignature de protéines sériques à sept marqueurs pour le diagnostic de la tuberculose active chez les patients africains des cliniques de soins de santé primaires présentant des signes et des symptômes évocateurs de la tuberculose. Thorax. 2016. Thorax. 2016;71(9):785-94. doi : 10.1136/thoraxjnl-2015-207999
21. Jacobs R, Malherbe S, Loxton AG, Stanley K, van der Spuy G, Walzl G, et al. Identification de nouveaux biomarqueurs hôtes dans le plasma en tant que candidats pour l'immunodiagnostic de la tuberculose et le suivi de la réponse au traitement de la tuberculose. Oncocible. 2016;7(36):57581-92. doi : 10.18632/oncotarget.11420
22. Neveling DP, van den Heever TS, Perold WJ, Dicks LMT. Un biocapteur à réseau de nanofils nanoforce ZnO pour la détection et la quantification des immunoglobulines. Capteurs et actionneurs B. 2014;203:102-10. https://doi.org/10.1016/j.snb.2014.06.076
23. Maas MB, Maybery GHC, Perold WJ, Neveling DP, Dicks LMT. Biocapteur à fibre optique en verre borosilicaté pour la détection d'Escherichia coli. Microbiologie actuelle. 2018;75(2):150-5. doi : 10.1007/s00284-017-1359-y.
24. Corstjens PL, Tjon Kon Fat EM, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Franken KL, Chegou NN, et al. Évaluation multicentrique d'un test de flux latéral convivial pour déterminer les niveaux d'IP-10 et de CCL4 dans le sang des cas de tuberculose et des cas non tuberculeux en Afrique. Biochimie clinique. 2016;49(1-2):22-31. doi : 10.1016/j.clinbiochem.2015.08.013
25. Sutherland JS, Mendy J, Gindeh A, Walzl G, Togun T, Owolabi O, et al. Utilisation des tests de flux latéral pour déterminer les niveaux d'IP-10 et de CCL4 dans les épanchements pleuraux et le sang total pour le diagnostic de la tuberculose. Tuberculose (Édimbourg, Écosse). 2016;96:31-6. doi : 10.1016/j.tube.2015.10.011.
26. Marais BJ, Heemskerk AD, Marais SS, van Crevel R, Rohlwink U, Caws M, et al. Méthodes standardisées pour améliorer la qualité et la comparabilité des études sur la méningite tuberculeuse. Maladies infectieuses cliniques : une publication officielle de l'Infectious Diseases Society of America. 2017;64(4):501-9. doi : 10.1093/cid/ciw757.
27. Kashyap RS, Dobos KM, Belisle JT, Purohit HJ, Chandak NH, Taori GM, et al. Démonstration des composants du complexe de l'antigène 85 dans le liquide céphalo-rachidien de patients atteints de méningite tuberculeuse. Immunologie de laboratoire clinique et diagnostique. 2005;12(6):752-8. DOI : 10.1128/CDLI.12.6.752-758.2005
28. du Preez K, Seddon JA, Schaaf HS, Hesseling AC, Starke JR, Osman M, et al. Pénurie mondiale de vaccin BCG et méningite tuberculeuse chez les enfants. The Lancet Santé mondiale. 2019;7(1):e28-e9. DOI :10.1016/S2214-109X(18)30474-1