反復性および慢性片頭痛患者におけるエンドカンナビノイドシステムの遺伝子発現

片頭痛は、その病態生理学が完全には解明されていない神経血管疾患です。 これは主に、片頭痛発作とその再発の根底にある複雑なメカニズムによるものです。 内因性カンナビノイド システム (ES) は、さまざまな生物学的プロセスに関与する複雑なシグナル伝達システムです (例: 神経活動、痛覚、免疫機能など）、体の恒常性の維持に重要な役割を果たしています。 ES 成分には内因性脂質が含まれ、最も研究されているのは N-アラキドノイルエタノールアミド (AEA) と 2-アラキドノイルグリセロール (2-AG)、それらの代謝酵素、および少なくとも 2 つのカンナビノイド受容体 (CB1 と CB2) です。 AEA の生合成は主に N-アシルホスファチジルエタノールアミド-ホスホリパーゼ D (NAPE-PLD) によって行われますが、2-AG はジアシルグリセロール リパーゼ (DAGL) の作用によって生成されます。 AEA は脂肪酸アミド加水分解酵素 (FAAH) によって代謝され、2-AG は主にモノアシルグリセロール リパーゼ (MAGL) によって代謝されます。

ES成分の遺伝子発現の変化には、生理学的および病理学的条件下の両方で、さまざまな細胞型、複数の異化経路、エピジェネティックなメカニズムによる活性代謝産物の生成が関与している可能性があります。 たとえば、CB遺伝子はさまざまな転写因子と相互作用する可能性があり、その多くはDNAメチル化とヒストン翻訳後修飾に関連しています。 機能不全の ES は、片頭痛を含む多くの障害に関連付けられています。 実際、ES は、片頭痛の病因に重要な役割を果たす複数の活動と神経調節物質/神経伝達物質を調節します。 ES は、脳幹求心性神経からの三叉神経血管侵害受容伝達の下降変調にも関係しています。 ラットへのニトログリセリン投与に基づく片頭痛特異的動物モデルを使用した統合自律神経系神経生理学研究所、頭痛科学センター、IRCCS モンディーノ財団、パヴィア (イタリア) からの以前の研究では、ES と痛みの媒介との間の相互作用の存在が実証されました。 . 特に、研究者らは、三叉神経の侵害受容シグナルの処理において、AEA および FAAH によって制御される AEA 活性が重要な役割を果たしていることを示しました。 AEA は神経原性硬膜血管拡張、ならびにカルシトニン遺伝子関連ペプチド誘導性および一酸化窒素誘導性硬膜血管拡張を阻害します。この活性は CB1 拮抗作用によって逆転します。 ES と片頭痛の痛みの間の相互作用は、臨床観察によっても示唆されています。 FAAH 活性は、反復性片頭痛 (EM) の女性の血小板でより高く、AEA のより顕著な分解を示唆しています。 慢性片頭痛 (CM) および薬物乱用 (MO) の被験者は、血小板だけでなく CSF においてもエンドカンナビノイド代謝の変化を示しました。 上記の臨床所見は散在し、再現されていますが、増加する前臨床証拠からのより最近のデータに照らしてそれらを再検討すると、片頭痛の病態生理における ES の役割をより深く調査する必要性が生じます。

いくつかの研究は、末梢血単核細胞 (PBMC) で検出された ES コンポーネントの変化が、さまざまな神経疾患における ES の中枢機能障害の信頼できる指標であることを示唆しています。 たとえば、パーキンソン病または多発性硬化症の患者では、AEA の CSF レベルの増加は、PBMC における FAAH の活性およびタンパク質含有量の減少と関連しており、これは AEA トーンの増加を示しています。 AEA レベルは CSF および統合失調症被験者の血液で上昇し、臨床的寛解後の PBMC では、AEA 血中レベルおよび CB2 と FAAH の mRNA 転写物が大幅に低下しました。

この研究の目的は、片頭痛の被験者における ES 活動の特定の機能パターンを特定することでした。 この目的のために、研究者は、前兆のないEM、CM-MO、および健康なコントロール（CT）の被験者の代表的なサンプルのPBMCで、ESの複数の周辺コンポーネント（遺伝子発現、タンパク質発現、およびDNAメチル化）の徹底的な評価を実行しました。

EM の 25 人の被験者、CM-MO の 26 人、CT の 24 人が、パヴィア (イタリア) の IRCCS モンディーノ財団の頭痛センターに登録されました。 この研究は地元の倫理委員会によって承認され、登録されたすべての被験者は書面によるインフォームドコンセントに署名しました。

血液サンプル (20 ml) は、参加者からエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含むチューブ内に収集されました。 血液サンプルをリン酸緩衝生理食塩水 1X (PBS 1X) (Sigma) で 1:1 の比率で希釈しました。 希釈した血液サンプルをフィコール分離溶液 (15ml) (Sigma) にゆっくりとロードし、室温で 30 分間、ブレーキなしで 800 g で遠心分離しました。 中央の白い単層として蓄積した PBMC を滅菌 PBS 1X で 2 回洗浄し、300 g で 15 分間遠心分離しました。 各サンプルについて、PBMC のバッチを RNA または DNA の抽出に使用し、別の PBMC をフローサイトメーター分析に使用しました。

3 つの研究グループの被験者から分離された PBMC で、研究者は次のことを分析しました。

• CB1 および CB2 タンパク質の発現。
• 次の遺伝子の発現: CB 受容体、FAAH、NAPE-PLD、MAGL、および DAGL
• ES コンポーネントの DNA メチル化。 PBMC における CB1 および CB2 タンパク質発現の相対レベルを決定するために、研究者は FACS Canto フローサイトメーター (Becton-Dickenson) を使用したフローサイトメトリーを使用しました。 分離後、CD45 (BD Biosciences、1:50)、CB1 (R&D system、1:50)、および CB2 受容体 (Cayman Chemical、1:30) に対する抗体を使用して、細胞 (1 反応あたり 100000) を染色しました。 CD45 染色と CB1 および CB2 との交点についてゲートをかけたウィンドウで、合計 10000 イベントがカウントされました。

標準手順（Zymo Research）を使用してPBMCからの全RNAを分離し、ナノドロップ分光光度計（Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific）を使用してRNAの品質を評価しました。 ｃＤＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ）を供給業者の指示に従って使用して生成した。 Fast Eva Green supermix (BIO-RAD) を使用して、CB 受容体、FAAH、NAPE-PLD、MAGL、および DAGL の遺伝子発現を分析しました。 ユビキチン (UBC) は、その発現がすべての実験グループで一定のままであり、ハウスキーピング遺伝子として使用されました。 供給者の指示に従って、ライトサイクラー４８０装置ｒｔ－ＰＣＲ検出システム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて増幅を行った。 すべてのサンプルを 3 回アッセイし、Ct 値を使用して 2-ΔCt = 2- (Ct 遺伝子 - Ct ハウスキーピング遺伝子) 式に従って遺伝子発現レベルを計算しました。

PBMC には、ニューロンや末梢の有核細胞を含むほとんどの組織に見られるエピジェネティックな酵素が完全に含まれているため、研究者は、登録されたすべての被験者の ES 遺伝子転写の調節における DNA メチル化の役割を評価しました。

QIAmp DNA Blood Mini Kit（Qiagen）を使用して全血からDNAを抽出し、その濃度をNanoDrop定量化（NanoDrop Techologies、Thermofisher）によって決定しました。 アレイの準備とデータ分析は、Genomix4Life srl (Baronissi、イタリア) によって行われました。 高品質の DNA (500 ng) は、EZ DNA メチル化キット (Zymo Research、Irvine、CA、USA) を使用してバイサルファイト変換されました。 21 231（99％）のRefSeq遺伝子をカバーする485 577のプローブを含むHumanMethylation 450 K BeadChip（イルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して、バイサルファイト変換DNA（200ng）を全ゲノムメチル化の分析に使用しました。 手短に言えば、重亜硫酸塩で変換された DNA を 20 時間全ゲノム増幅し、続いてエンドポイントの断片化を行いました。 断片化した DNA を沈殿させ、変性させ、48 °C で 20 時間 BeadChip にハイブリダイズさせました。 BeadChip を洗浄し、ハイブリダイズしたプライマーを伸長して標識した後、Illumina iScan システムを使用して BeadChip をスキャンしました。 GenomeStudio ソフトウェア (バージョン 2011.1; Illumina Inc.) を使用して、スキャンしたアレイからの DNA メチル化シグナルを抽出しました。 各シトシンのメチル化レベルは、プローブのメチル化バージョンと非メチル化バージョンの蛍光強度比として計算されたベータ値として表されました。ベータ値は 0 (非メチル化) から 1 (メチル化) の範囲でした。 CGI に関連する注釈は、次の分類を使用します。 「棚」、海岸に隣接する 2 kb の配列のそれぞれ。 TSS200 と TSS1500 は、それぞれ TSS から -200 bp と -1500 bp の間の領域を示します。 与えられた 2 つの遺伝子座間の有意なメチル化の違いは、デルタ-ベータ値で示され、DiffScores (DiffScore⩽-30.0 (≈ pval <0.001)=低メチル化; DiffScore⩾30.0 (≈ p val<0.001)=ハイパーメチル化)。