Ekspresja genów układu endokannabinoidowego u pacjentów z migreną epizodyczną i przewlekłą

Migrena jest chorobą naczyniowo-nerwową, której patofizjologia jest daleka od pełnego wyjaśnienia. Wynika to głównie ze złożonych mechanizmów leżących u podstaw napadu migreny, jak również jej nawrotów. Układ endokannabinoidowy (ES) to złożony system sygnalizacyjny zaangażowany w różne procesy biologiczne (np. aktywność neuronów, odczuwanie bólu i funkcje odpornościowe) oraz odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy organizmu. Składniki ES obejmują endogenne lipidy, z których najlepiej zbadane to N-arachidonoiloetanoloamid (AEA) i 2-arachidonoiloglicerol (2-AG), ich enzymy metaboliczne i co najmniej dwa receptory kannabinoidowe (CB1 i CB2). Biosynteza AEA zachodzi głównie przez N-acylofosfatydyloetanoloamido-fosfolipazę D (NAPE-PLD), podczas gdy 2-AG jest wytwarzany przez działanie lipazy diacyloglicerolowej (DAGL). AEA jest metabolizowana przez hydrolazę amidów kwasów tłuszczowych (FAAH), a 2-AG głównie przez lipazę monoacyloglicerolową (MAGL).

Zmiany w ekspresji genów składników ES mogą obejmować różne typy komórek, wiele szlaków katabolicznych i wytwarzanie aktywnych metabolitów poprzez mechanizmy epigenetyczne, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Na przykład geny CB mogą wchodzić w interakcje z różnymi czynnikami transkrypcyjnymi, z których wiele jest związanych z metylacją DNA i posttranslacyjnymi modyfikacjami histonów. Dysfunkcyjny ES jest związany z licznymi zaburzeniami, w tym migreną. ES rzeczywiście moduluje wiele czynności i neuromodulatorów/neuroprzekaźników, które odgrywają kluczową rolę w patogenezie migreny. ES jest również zaangażowany w zstępującą modulację nocyceptywnej transmisji trójdzielno-naczyniowej z aferentów pnia mózgu. Wcześniejsze badania z Laboratorium Neurofizjologii Integracyjnych Systemów Autonomicznych, Headache Science Centre, IRCCS Mondino Foundation, Pavia (Włochy), z wykorzystaniem specyficznego dla migreny modelu zwierzęcego opartego na podawaniu nitrogliceryny szczurom, wykazały istnienie interakcji między ES a mediacją bólu . W szczególności badacze wykazali kluczową rolę AEA i regulowanej przez FAAH aktywności AEA w przetwarzaniu nocyceptywnych sygnałów nerwu trójdzielnego. AEA hamuje neurogenne rozszerzenie naczyń opony twardej, jak również związane z kalcytoniną wywołane peptydem i tlenkiem azotu rozszerzenie naczyń opony twardej, aktywność, która jest odwracana przez antagonizm CB1. Obserwacje kliniczne sugerują również interakcję między ES a bólem migrenowym. Aktywność FAAH była wyższa w płytkach krwi kobiet z epizodyczną migreną (EM), co sugeruje wyraźniejszą degradację AEA. Osoby z przewlekłą migreną (CM) i nadużywaniem leków (MO) wykazywały zmieniony metabolizm endokannabinoidów nie tylko w płytkach krwi, ale także w płynie mózgowo-rdzeniowym. Chociaż powyższe obserwacje kliniczne są rozproszone i powtarzalne, ich ponowne rozważenie w świetle nowszych danych z coraz większej liczby dowodów przedklinicznych skłania do głębszego zbadania roli ES w patofizjologii migreny.

Kilka badań sugeruje, że zmiany w składnikach ES wykryte w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (PBMC) są wiarygodnymi wskaźnikami centralnej dysfunkcji ES w różnych chorobach neurologicznych. Na przykład u pacjentów z chorobą Parkinsona lub stwardnieniem rozsianym zwiększone poziomy AEA w płynie mózgowo-rdzeniowym były związane ze zmniejszeniem aktywności i zawartości białka FAAH w PBMC, co wskazuje na zwiększone napięcie AEA. Poziomy AEA były podwyższone w płynie mózgowo-rdzeniowym i we krwi pacjentów ze schizofrenią, ze znacznym spadkiem poziomów AEA we krwi i transkryptów mRNA CB2 i FAAH w PBMC po remisji klinicznej.

Celem pracy była identyfikacja specyficznych wzorców funkcjonalnych aktywności ES u osób z migreną. W tym celu badacze przeprowadzili dogłębną ocenę wielu obwodowych składników ES (ekspresja genów, ekspresja białek i metylacja DNA) w PBMC reprezentatywnych próbek pacjentów z EM bez aury, CM-MO oraz zdrowych kontroli (CT).

Dwudziestu pięciu pacjentów z EM, 26 z CM-MO i 24 CT zostało zapisanych do ośrodka leczenia bólu głowy Fundacji IRCCS Mondino w Pawii (Włochy). Badanie zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną, a wszyscy włączeni pacjenci podpisali pisemną świadomą zgodę.

Próbki krwi (20 ml) pobrano od uczestników w probówkach zawierających kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Próbki krwi rozcieńczono w stosunku 1:1 solanką buforowaną fosforanem 1X (PBS 1X) (Sigma). Rozcieńczone próbki krwi powoli ładowano do roztworu rozdzielającego Ficoll (15 ml) (Sigma) i wirowano przy 800 g bez hamulca przez 30 minut w temperaturze pokojowej. PBMC nagromadzone jako środkowa biała pojedyncza warstwa, przemyto dwukrotnie sterylnym PBS 1X i odwirowano przy 300 g przez 15 min. Dla każdej próbki stosowano partię PBMC do ekstrakcji RNA lub DNA, a drugą do analizy na cytometrze przepływowym.

W PBMC wyizolowanych od osób z 3 grup badawczych badacze zbadali:

• ekspresja białek CB1 i CB2;
• ekspresja następujących genów: receptory CB, FAAH, NAPE-PLD, MAGL i DAGL
• Metylacja DNA składników ES. Aby określić względny poziom ekspresji białek CB1 i CB2 w PBMC, badacze zastosowali cytometrię przepływową z cytometrem przepływowym FACS Canto (Becton-Dickenson). Po izolacji komórki (100000 na reakcję) barwiono przy użyciu przeciwciał przeciwko receptorom CD45 (BD Biosciences, 1:50), CB1 (system R&D, 1:50) i CB2 (Cayman Chemical, 1:30); łącznie zliczono 10000 zdarzeń w oknach bramkowanych dla przecięcia barwienia CD45 z CB1 i CB2.

Całkowity RNA z PBMC wyizolowano przy użyciu standardowej procedury (Zymo Research), a jakość RNA oceniono przy użyciu spektrofotometru nanodrop (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific); cDNA wygenerowano przy użyciu zestawu iScript cDNA Synthesis (Biorad) zgodnie z instrukcjami dostawcy. Ekspresję genów receptorów CB, FAAH, NAPE-PLD, MAGL i DAGL analizowano przy użyciu supermiksu Fast Eva Green (BIO-RAD). Ubikwitynę (UBC), której ekspresja pozostawała stała we wszystkich grupach eksperymentalnych, użyto jako genu metabolizmu podstawowego. Amplifikację przeprowadzono za pomocą light Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System (Roche) zgodnie z instrukcjami dostawcy. Wszystkie próbki badano w trzech powtórzeniach i obliczano poziomy ekspresji genów zgodnie ze wzorem 2-∆Ct = 2- (gen Ct - gen metabolizmu podstawowego Ct) przy użyciu wartości Ct.

Ponieważ PBMC zawierają pełny zestaw enzymów epigenetycznych występujących w większości tkanek, w tym w neuronach i obwodowych komórkach jądrzastych, badacze ocenili rolę metylacji DNA w regulacji transkrypcji genu ES u wszystkich włączonych pacjentów.

DNA ekstrahowano z krwi pełnej przy użyciu zestawu QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen), a jego stężenie określono za pomocą oznaczenia ilościowego NanoDrop (NanoDrop Techologies, Thermofisher). Przygotowanie macierzy i analizę danych przeprowadziła firma Genomix4Life srl (Baronissi, Włochy). Wysokiej jakości DNA (500 ng) przekształcono wodorosiarczynem przy użyciu zestawu do metylacji DNA EZ (Zymo Research, Irvine, CA, USA). DNA przekształcone wodorosiarczynem (200 ng) zastosowano do analizy metylacji całego genomu przy użyciu HumanMethylation 450 K BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA), który zawiera 485 577 sond obejmujących 21 231 (99%) genów RefSeq. W skrócie, przekształcony wodorosiarczynem DNA amplifikowano cały genom przez 20 godzin, a następnie fragmentację w punkcie końcowym. Fragmentowany DNA wytrącono, zdenaturowano i hybrydyzowano z BeadChips przez 20 godzin w 48 ° C. BeadChips przemyto, a zhybrydyzowane startery przedłużono i wyznakowano przed zeskanowaniem BeadChips przy użyciu systemu Illumina iScan. oprogramowanie GenomeStudio (wersja 2011.1; Illumina Inc.) użyto do ekstrakcji sygnałów metylacji DNA z zeskanowanych macierzy. Poziom metylacji dla każdej cytozyny wyrażono jako wartość beta obliczoną jako stosunek intensywności fluorescencji zmetylowanych do niemetylowanych wersji sond: wartości beta mieściły się w zakresie od 0 (niemetylowane) do 1 (metylowane). Adnotacja odnosząca się do CGI wykorzystuje następującą kategoryzację: „shore”, każda z sekwencji 2 kb otaczających CGI; „półka”, każda z sekwencji 2 kb obok brzegu; „otwarte morze”, DNA nieuwzględnione w żadnej z poprzednich sekwencji lub w CGI 4. TSS200 i TSS1500 wskazują odpowiednio region między pozycją -200 pz a -1500 pz od TSS. Znacząca różnica metylacji między dwoma podanymi loci jest wskazywana przez wartość delta-beta i określana za pomocą modułu metylacji GenomeStudio przy użyciu niestandardowego algorytmu Illumina do obliczania DiffScores (DiffScore⩽-30,0 (≈ pval <0,001) = hipometylacja; Wynik różnicowy⩾30,0 (≈ p val<0,001)=hipermetylacja).