Genexpression des Endocannabinoid-Systems bei Patienten mit episodischer und chronischer Migräne

Migräne ist eine neurovaskuläre Erkrankung, deren Pathophysiologie noch lange nicht vollständig geklärt ist. Dies liegt vor allem an den komplexen Mechanismen, die dem Migräneanfall sowie seinem Wiederauftreten zugrunde liegen. Das Endocannabinoid-System (ES) ist ein komplexes Signalsystem, das an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt ist (z. neuronale Aktivität, Schmerzempfindung und Immunfunktionen) und spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Körperhomöostase. Die ES-Komponenten umfassen die endogenen Lipide, die am besten untersuchten sind N-Arachidonoylethanolamid (AEA) und 2-Arachidonoylglycerol (2-AG), ihre metabolischen Enzyme und mindestens zwei Cannabinoid-Rezeptoren (CB1 und CB2). Die Biosynthese von AEA erfolgt hauptsächlich durch N-Acylphosphatidylethanolamid-Phospholipase D (NAPE-PLD), während 2-AG durch die Wirkung von Diacylglycerollipase (DAGL) produziert wird. AEA wird durch Fettsäureamidhydrolase (FAAH) und 2-AG hauptsächlich durch Monoacylglycerollipase (MAGL) metabolisiert.

Veränderungen in der Genexpression von ES-Komponenten können verschiedene Zelltypen, mehrere Abbauwege und die Erzeugung aktiver Metaboliten über epigenetische Mechanismen sowohl unter physiologischen als auch pathologischen Bedingungen betreffen. CB-Gene können beispielsweise mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren interagieren, von denen viele mit DNA-Methylierung und posttranslationalen Histonmodifikationen zusammenhängen. Ein dysfunktionales ES wurde mit zahlreichen Erkrankungen, einschließlich Migräne, in Verbindung gebracht. Das ES moduliert in der Tat mehrere Aktivitäten und Neuromodulatoren/Neurotransmitter, die eine entscheidende Rolle bei der Migräne-Pathogenese spielen. ES ist auch an der absteigenden Modulation der trigeminovaskulären nozizeptiven Übertragung von den Hirnstammafferenzen beteiligt. Frühere Studien des Laboratory of Neurophysiology of Integrative Autonomic Systems, Headache Science Center, IRCCS Mondino Foundation, Pavia (Italien), unter Verwendung des Migräne-spezifischen Tiermodells auf der Grundlage der Nitroglycerin-Verabreichung bei Ratten, zeigten die Existenz von Wechselwirkungen zwischen ES und Schmerzvermittlung . Insbesondere zeigten die Forscher eine Schlüsselrolle für AEA und für die FAAH-regulierte AEA-Aktivität bei der Verarbeitung von trigeminalen nozizeptiven Signalen. AEA hemmt die neurogene durale Vasodilatation sowie die durch das Calcitonin-Gen induzierte Peptid-induzierte und Stickoxid-induzierte durale Gefäßerweiterung, eine Aktivität, die durch CB1-Antagonismus umgekehrt wird. Die Wechselwirkung zwischen ES und Migräneschmerz wird auch durch klinische Beobachtungen nahegelegt. Die FAAH-Aktivität war in Blutplättchen von Frauen mit episodischer Migräne (EM) höher, was auf einen ausgeprägteren Abbau von AEA hindeutet. Personen mit chronischer Migräne (CM) und Medikamentenübergebrauch (MO) zeigten einen veränderten Endocannabinoid-Metabolismus nicht nur in Blutplättchen, sondern auch im Liquor. Obwohl die oben genannten klinischen Befunde verstreut und repliziert sind, führt ihre erneute Betrachtung im Licht neuerer Daten aus der zunehmenden präklinischen Evidenz zu der Notwendigkeit, die Rolle von ES in der Pathophysiologie der Migräne eingehender zu untersuchen.

Mehrere Studien deuten darauf hin, dass Veränderungen in ES-Komponenten, die in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) nachgewiesen werden, zuverlässige Indikatoren für eine zentrale Dysfunktion des ES bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen sind. Beispielsweise waren bei Patienten mit Parkinson-Krankheit oder multipler Sklerose erhöhte CSF-Spiegel von AEA mit einer Verringerung der Aktivität und des Proteingehalts von FAAH in PBMCs verbunden, was auf einen erhöhten AEA-Ton hinweist. Die AEA-Spiegel waren im Liquor und im Blut schizophrener Patienten erhöht, mit einem signifikanten Rückgang der AEA-Blutspiegel und der mRNA-Transkripte von CB2 und FAAH in PBMCs nach klinischer Remission.

Das Ziel dieser Studie war die Identifizierung spezifischer funktioneller Muster der ES-Aktivität bei Probanden mit Migräne. Zu diesem Zweck führten die Forscher eine gründliche Bewertung mehrerer peripherer Komponenten des ES (Genexpression, Proteinexpression und DNA-Methylierung) in PBMCs von repräsentativen Proben von Probanden mit EM ohne Aura, CM-MO und in gesunden Kontrollen (CT) durch.

25 Probanden mit EM, 26 mit CM-MO und 24 CT wurden in das Kopfschmerzzentrum der IRCCS Mondino Foundation in Pavia (Italien) eingeschrieben. Die Studie wurde von der lokalen Ethikkommission genehmigt und alle eingeschriebenen Probanden unterzeichneten eine schriftliche Einverständniserklärung.

Blutproben (20 ml) wurden in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthaltenden Röhrchen von Teilnehmern gesammelt. Blutproben wurden im Verhältnis 1:1 mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung 1X (PBS 1X) (Sigma) verdünnt. Verdünnte Blutproben wurden langsam auf Ficoll-Trennlösung (15 ml) (Sigma) aufgetragen und bei 800 g ohne Bremse für 30 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Als mittlere weiße Monoschicht angesammelte PBMCs wurden zweimal in sterilem PBS 1X gewaschen und bei 300 g für 15 min zentrifugiert. Für jede Probe wurde eine Charge PBMCs für die RNA- oder DNA-Extraktion und eine weitere für die Durchflusszytometeranalyse verwendet.

In den PBMCs, die von den Probanden in den 3 Studiengruppen isoliert wurden, testeten die Forscher:

• CB1- und CB2-Proteinexpression;
• Expression der folgenden Gene: CB-Rezeptoren, FAAH, NAPE-PLD, MAGL und DAGL
• DNA-Methylierung von ES-Komponenten. Um das relative Niveau der CB1- und CB2-Proteinexpression in PBMCs zu bestimmen, verwendeten die Forscher Durchflusszytometrie mit einem FACS-Canto-Durchflusszytometer (Becton-Dickenson). Nach der Isolierung wurden die Zellen (100.000 pro Reaktion) unter Verwendung von Antikörpern gegen CD45- (BD Biosciences, 1:50), CB1- (R&D-System, 1:50) und CB2-Rezeptoren (Cayman Chemical, 1:30) gefärbt; insgesamt 10000 Ereignisse wurden in Fenstern gezählt, die für den Schnittpunkt der CD45-Färbung mit CB1 und CB2 torgesteuert waren.

Gesamt-RNA aus PBMCs wurde unter Verwendung eines Standardverfahrens (Zymo Research) isoliert und die RNA-Qualität wurde unter Verwendung eines Nanodrop-Spektrophotometers (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific) bewertet; cDNA wurde unter Verwendung des iScript-cDNA-Synthesekits (Biorad) gemäß den Anweisungen des Lieferanten erzeugt. Die Genexpression von CB-Rezeptoren, FAAH, NAPE-PLD, MAGL und DAGL wurde mit dem Fast Eva Green Supermix (BIO-RAD) analysiert. Als Housekeeping-Gen wurde Ubiquitin (UBC) verwendet, dessen Expression in allen Versuchsgruppen konstant blieb. Die Amplifikation wurde mit einem Light Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System (Roche) gemäß den Anweisungen des Lieferanten durchgeführt. Alle Proben wurden dreifach getestet und die Genexpressionsniveaus wurden gemäß der Formel 2-∆Ct = 2-(Ct-Gen - Ct-Haushaltsgen) unter Verwendung von Ct-Werten berechnet.

Da PBMCs das vollständige Komplement epigenetischer Enzyme enthalten, die in den meisten Geweben vorkommen, einschließlich Neuronen und peripheren kernhaltigen Zellen, bewerteten die Forscher die Rolle der DNA-Methylierung bei der Regulation der ES-Gentranskription bei allen eingeschriebenen Probanden.

DNA wurde mit dem QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) aus Vollblut extrahiert und ihre Konzentration durch NanoDrop-Quantifizierung (NanoDrop Technologies, Thermofisher) bestimmt. Die Vorbereitung der Arrays und die Datenanalyse wurden von Genomix4Life srl (Baronissi, Italien) durchgeführt. Hochwertige DNA (500 ng) wurde unter Verwendung des EZ-DNA-Methylierungskits (Zymo Research, Irvine, CA, USA) Bisulfit-konvertiert. Bisulfit-konvertierte DNA (200 ng) wurde zur Analyse der Gesamtgenom-Methylierung unter Verwendung des HumanMethylation 450 K BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) verwendet, der 485.577 Sonden enthält, die 21.231 (99 %) RefSeq-Gene abdecken. Kurz gesagt, Bisulfit-konvertierte DNA wurde 20 h lang im gesamten Genom amplifiziert, gefolgt von einer Endpunktfragmentierung. Fragmentierte DNA wurde ausgefällt, denaturiert und für 20 h bei 48 °C an die BeadChips hybridisiert. Die BeadChips wurden gewaschen und die hybridisierten Primer verlängert und markiert, bevor die BeadChips mit dem Illumina iScan-System gescannt wurden. GenomeStudio-Software (Version 2011.1; Illumina Inc.) wurde für die Extraktion von DNA-Methylierungssignalen aus gescannten Arrays verwendet. Der Methylierungsgrad für jedes Cytosin wurde als Beta-Wert ausgedrückt, der als Fluoreszenzintensitätsverhältnis der methylierten zu nicht-methylierten Versionen der Sonden berechnet wurde: Beta-Werte lagen im Bereich zwischen 0 (nicht methyliert) und 1 (methyliert). Die Anmerkung bezüglich CGIs verwendet die folgende Kategorisierung: „Ufer“, jede der 2-kb-Sequenzen flankiert ein CGI; 'Regal', jede der 2-kb-Sequenzen neben einem Ufer; 'offenes Meer', DNA, die in keiner der vorherigen Sequenzen oder in CGIs enthalten ist 4. TSS200 und TSS1500 zeigen die Region zwischen Position –200 bp bzw. –1500 bp vom TSS an. Der signifikante Methylierungsunterschied zwischen zwei gegebenen Loci wird durch einen Delta-Beta-Wert angezeigt und mit dem GenomeStudio Methylation Module unter Verwendung des benutzerdefinierten Algorithmus von Illumina zur Berechnung von DiffScores (DiffScore⩽-30.0 (≈ pval <0,001)=Hypomethylierung; DiffScore⩾30.0 (≈ p val<0.001)=Hypermethylierung).