Genuttrykk av endocannabinoidsystem hos episodiske og kroniske migrenepasienter

Migrene er en nevrovaskulær sykdom hvis patofysiologi langt fra er helt avklart. Dette skyldes hovedsakelig de komplekse mekanismene som ligger til grunn for migreneanfall, så vel som dets tilbakefall. Det endocannabinoide systemet (ES) er et komplekst signalsystem involvert i forskjellige biologiske prosesser (f. neuronal aktivitet, smertefølelse og immunfunksjoner), og det spiller en avgjørende rolle i opprettholdelsen av kroppens homeostase. ES-komponentene inkluderer de endogene lipidene, de mest studerte er N-arachidonoylethanolamid (AEA) og 2-arachidonoylglycerol (2-AG), deres metabolske enzymer og minst to cannabinoidreseptorer (CB1 og CB2). Biosyntesen av AEA skjer hovedsakelig av N-acylfosfatidyletanolamid-fosfolipase D (NAPE-PLD), mens 2-AG produseres gjennom virkningen av diacylglycerol lipase (DAGL). AEA metaboliseres av fettsyreamidhydrolase (FAAH) og 2-AG hovedsakelig av monoacylglycerollipase (MAGL).

Endringer i genuttrykk av ES-komponenter kan involvere ulike celletyper, flere katabolske veier og generering av aktive metabolitter via epigenetiske mekanismer, under både fysiologiske og patologiske forhold. CB-gener, for eksempel, kan samhandle med forskjellige transkripsjonelle faktorer, hvorav mange er relatert til DNA-metylering og post-translasjonelle modifikasjoner av histon. En dysfunksjonell ES har vært assosiert med en rekke lidelser, inkludert migrene. ES modulerer faktisk flere aktiviteter og nevromodulatorer/nevrotransmittere som spiller en avgjørende rolle i migrenepatogenese. ES er også involvert i den synkende moduleringen av den trigeminovaskulære nociseptive overføringen fra hjernestammen afferent. Tidligere studier fra Laboratory of Neurophysiology of Integrative Autonomic Systems, Headache Science Centre, IRCCS Mondino Foundation, Pavia (Italia), ved bruk av den migrenespesifikke dyremodellen basert på nitroglyserinadministrasjon i rotter, demonstrerte eksistensen av interaksjoner mellom ES og smertemediering . Spesielt viste etterforskerne en nøkkelrolle for AEA og for FAAH-regulert AEA-aktivitet i behandlingen av trigeminus nociceptive signaler. AEA hemmer nevrogen dural vasodilatasjon, så vel som kalsitoningen-relatert peptidindusert og nitrogenoksid-indusert dural karutvidelse, en aktivitet som reverseres av CB1-antagonisme. Interaksjonen mellom ES og migrenesmerter antydes også av kliniske observasjoner. FAAH-aktiviteten var høyere i blodplater hos kvinner med episodisk migrene (EM) for å antyde en mer markert nedbrytning av AEA. Personer med kronisk migrene (CM) og overforbruk av medisiner (MO) viste en endret endocannabinoid metabolisme ikke bare i blodplater, men også i CSF. Selv om de ovennevnte kliniske funnene er spredt og replikert, gjør revurderingen av dem i lys av nyere data fra de økende prekliniske bevisene behovet for å undersøke mer dyptgående rollen til ES i migrenepatofysiologien.

Flere studier tyder på at endringer i ES-komponenter oppdaget i perifere mononukleære blodceller (PBMC) er pålitelige indikatorer på en sentral dysfunksjon av ES ved forskjellige nevrologiske sykdommer. For eksempel, hos pasienter med Parkinsons sykdom eller multippel sklerose, var økte CSF-nivåer av AEA assosiert med en reduksjon i aktiviteten og proteininnholdet av FAAH i PBMC-er, noe som indikerer en økt AEA-tonus. AEA-nivåer var forhøyet i CSF og i blodet til schizofrene personer, med et betydelig fall i AEA-blodnivåer og i mRNA-transkripsjoner av CB2 og FAAH i PBMC etter klinisk remisjon.

Målet med denne studien var identifisering av spesifikke funksjonelle mønstre av ES-aktivitet hos personer med migrene. For dette formål utførte etterforskerne en grundig evaluering av flere perifere komponenter av ES (genuttrykk, proteinuttrykk og DNA-metylering) i PBMC-er av representative prøver av forsøkspersoner med EM uten aura, CM-MO og i friske kontroller (CT).

25 personer med EM, 26 med CM-MO og 24 CT ble registrert i hodepinesenteret til IRCCS Mondino Foundation of Pavia (Italia). Studien ble godkjent av den lokale etiske komiteen og alle påmeldte underskrev et skriftlig informert samtykke.

Blodprøver (20 ml) ble samlet inn i etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) som inneholder rør fra deltakerne. Blodprøver ble fortynnet i forholdet 1:1 med fosfatbuffer saltvann 1X (PBS 1X) (Sigma). Fortynnede blodprøver ble sakte fylt på Ficoll separasjonsløsning (15 ml) (Sigma) og sentrifugert ved 800 g uten brems i 30 minutter ved romtemperatur. PBMC-er akkumulert som det midterste hvite monolaget, ble vasket to ganger i steril PBS 1X og sentrifugert ved 300 g i 15 minutter. For hver prøve ble en batch med PBMC-er brukt for RNA- eller DNA-ekstraksjon og en annen for flow-cytometeranalyse.

I PBMC-ene isolert fra forsøkspersonene i de 3 studiegruppene analyserte etterforskerne:

• CB1 og CB2 proteinekspresjon;
• uttrykk for følgende gener: CB-reseptorer, FAAH, NAPE-PLD, MAGL og DAGL
• DNA-metylering av ES-komponenter. For å bestemme det relative nivået av CB1- og CB2-proteinuttrykk i PBMC-er, brukte etterforskerne flow-cytometri med et FACS Canto flow-cytometer (Becton-Dickenson). Etter isolering ble celler (100 000 per reaksjon) farget ved bruk av antistoffer mot CD45 (BD Biosciences, 1:50), CB1 (FoU-system, 1:50) og CB2-reseptorer (Cayman Chemical, 1:30); totalt 10 000 hendelser ble talt i vinduer som er lukket for skjæringspunktet mellom CD45-farging og CB1 og CB2.

Totalt RNA fra PBMC-er ble isolert ved bruk av standardprosedyre (Zymo Research) og RNA-kvalitet ble vurdert ved bruk av et nanodrop-spektrofotometer (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific); cDNA ble generert ved bruk av iScript cDNA Synthesis kit (Biorad) etter leverandørens instruksjoner. Genekspresjon av CB-reseptorer, FAAH, NAPE-PLD, MAGL og DAGL ble analysert ved bruk av Fast Eva Green supermix (BIO-RAD). Ubiquitin (UBC), hvis uttrykk forble konstant i alle eksperimentelle grupper, ble brukt som husholdningsgen. Amplifikasjonen ble utført med et lett Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System (Roche) etter leverandørens instruksjoner. Alle prøver ble analysert i triplikat og genekspresjonsnivåer ble beregnet i henhold til 2-∆Ct = 2- (Ct-gen - Ct-husholdningsgen) formel ved å bruke Ct-verdier.

Siden PBMC-er inneholder det fulle komplementet av epigenetiske enzymer som finnes i de fleste vev, inkludert nevroner og perifere kjerneholdige celler, evaluerte etterforskerne rollen til DNA-metylering i reguleringen av ES-gentranskripsjon hos alle de påmeldte.

DNA ble ekstrahert fra fullblod ved bruk av QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) og konsentrasjonen ble bestemt ved NanoDrop-kvantifisering (NanoDrop Techologies, Thermofisher). Matriseforberedelse og dataanalyse ble utført av Genomix4Life srl (Baronissi, Italia). Høykvalitets DNA (500 ng) ble bisulfitt omdannet ved bruk av EZ DNA-metyleringssett (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Bisulfitt-konvertert DNA (200 ng) ble brukt for analyse av hel-genom-metylering, ved bruk av HumanMethylation 450 K BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA), som inneholder 485 577 prober som dekker 21 231 (99 %) RefSeq-gener. Kort fortalt ble bisulfittkonvertert DNA helgenomamplifisert i 20 timer etterfulgt av endepunktsfragmentering. Fragmentert DNA ble presipitert, denaturert og hybridisert til BeadChips i 20 timer ved 48 °C. BeadChips ble vasket og de hybridiserte primerne ble utvidet og merket før de ble skannet BeadChips ved bruk av Illumina iScan-systemet. Programvare GenomeStudio (versjon 2011.1; Illumina Inc.) ble brukt for ekstraksjon av DNA-metyleringssignaler fra skannede arrays. Metyleringsnivået for hvert cytosin ble uttrykt som en betaverdi beregnet som fluorescensintensitetsforholdet til de metylerte til umetylerte versjonene av probene: betaverdier varierte mellom 0 (umetylert) og 1 (metylert). Merknaden knyttet til CGI-er bruker følgende kategorisering: 'shore', hver av 2-kb-sekvensene som flankerer en CGI; 'hylle', hver av 2-kb-sekvensene ved siden av en strand; 'åpent hav', DNA som ikke er inkludert i noen av de tidligere sekvensene eller i CGIs 4. TSS200 og TSS1500 indikerer området mellom henholdsvis posisjon -200 bp og -1500 bp fra TSS. Den signifikante metyleringsforskjellen mellom to gitte loki indikeres med en delta-beta-verdi og bestemmes med GenomeStudio Methylation Module ved å bruke Illumina tilpasset algoritme for å beregne DiffScores (DiffScore⩽-30.0 (≈ pval <0,001)=hypometylering; DiffScore⩾30,0 (≈ p val<0,001)=hypermetylering).