Genekspression af endocannabinoidsystem hos episodiske og kroniske migrænepatienter

Migræne er en neurovaskulær sygdom, hvis patofysiologi langt fra er helt afklaret. Dette skyldes hovedsageligt de komplekse mekanismer, der ligger til grund for migræneanfald, samt dets gentagelse. Det endocannabinoide system (ES) er et komplekst signalsystem involveret i forskellige biologiske processer (f. neuronal aktivitet, smertefornemmelse og immunfunktioner), og det spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af ​​kroppens homeostase. ES-komponenterne omfatter de endogene lipider, de mest undersøgte er N-arachidonoylethanolamid (AEA) og 2-arachidonoylglycerol (2-AG), deres metaboliske enzymer og mindst to cannabinoidreceptorer (CB1 og CB2). Biosyntesen af ​​AEA sker hovedsageligt af N-acylphosphatidylethanolamid-phospholipase D (NAPE-PLD), hvorimod 2-AG produceres gennem virkningen af ​​diacylglycerollipase (DAGL). AEA metaboliseres af fedtsyreamidhydrolase (FAAH) og 2-AG hovedsageligt af monoacylglycerollipase (MAGL).

Ændringer i genekspression af ES-komponenter kan involvere forskellige celletyper, multiple kataboliske veje og generering af aktive metabolitter via epigenetiske mekanismer under både fysiologiske og patologiske forhold. CB-gener kan for eksempel interagere med forskellige transkriptionsfaktorer, hvoraf mange er relateret til DNA-methylering og post-translationelle modifikationer af histon. En dysfunktionel ES er blevet forbundet med adskillige lidelser, herunder migræne. ES modulerer faktisk flere aktiviteter og neuromodulatorer/neurotransmittere, der spiller en afgørende rolle i migrænepatogenese. ES er også impliceret i den faldende modulering af den trigeminovaskulære nociceptive transmission fra hjernestammens afferenter. Tidligere undersøgelser fra Laboratory of Neurophysiology of Integrative Autonomic Systems, Headache Science Center, IRCCS Mondino Foundation, Pavia (Italien), ved brug af den migrænespecifikke dyremodel baseret på nitroglycerinadministration i rotter, viste eksistensen af ​​interaktioner mellem ES og smertemediering . Især viste efterforskerne en nøglerolle for AEA og for FAAH-reguleret AEA-aktivitet i behandlingen af ​​trigeminus nociceptive signaler. AEA hæmmer neurogen dural vasodilatation såvel som calcitoningen-relateret peptid-induceret og nitrogenoxid-induceret dural karudvidelse, en aktivitet, der vendes af CB1-antagonisme. Interaktionen mellem ES og migrænesmerter antydes også af kliniske observationer. FAAH-aktivitet var højere i blodplader hos kvinder med episodisk migræne (EM) for at antyde en mere markant nedbrydning af AEA. Forsøgspersoner med kronisk migræne (CM) og medicinoverforbrug (MO) viste en ændret endocannabinoid metabolisme ikke kun i blodplader, men også i CSF. Selvom de ovennævnte kliniske fund er spredte og replikeres, giver deres genovervejelse i lyset af nyere data fra den stigende præ-kliniske evidens behov for at undersøge mere dybdegående ES' rolle i migrænepatofysiologien.

Adskillige undersøgelser tyder på, at ændringer i ES-komponenter påvist i perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) er pålidelige indikatorer for en central dysfunktion af ES i forskellige neurologiske sygdomme. For eksempel, hos patienter med Parkinsons sygdom eller dissemineret sklerose, var øgede CSF-niveauer af AEA forbundet med en reduktion i aktiviteten og proteinindholdet af FAAH i PBMC'er, hvilket er tegn på en øget AEA-tonus. AEA-niveauer var forhøjede i CSF og i blodet hos skizofrene forsøgspersoner med et signifikant fald i AEA-blodniveauer og i mRNA-transkripter af CB2 og FAAH i PBMC'er efter klinisk remission.

Formålet med denne undersøgelse var identifikation af specifikke funktionelle mønstre for ES-aktivitet hos personer med migræne. Til dette formål udførte efterforskerne en grundig evaluering af flere perifere komponenter af ES (genekspression, proteinekspression og DNA-methylering) i PBMC'er af repræsentative prøver af forsøgspersoner med EM uden aura, CM-MO og i sunde kontroller (CT).

Femogtyve forsøgspersoner med EM, 26 med CM-MO og 24 CT blev tilmeldt hovedpinecentret hos IRCCS Mondino Foundation of Pavia (Italien). Undersøgelsen blev godkendt af den lokale etiske komité, og alle tilmeldte forsøgspersoner underskrev et skriftligt informeret samtykke.

Blodprøver (20 ml) blev opsamlet i ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) indeholdende rør fra deltagerne. Blodprøver blev fortyndet i forholdet 1:1 med phosphatbuffer saltvand 1X (PBS 1X) (Sigma). Fortyndede blodprøver blev langsomt fyldt på Ficoll-separeringsopløsning (15 ml) (Sigma) og centrifugeret ved 800 g uden bremse i 30 minutter ved stuetemperatur. PBMC'er akkumuleret som det mellemste hvide monolag, blev vasket to gange i steril PBS 1X og centrifugeret ved 300 g i 15 min. For hver prøve blev en batch af PBMC'er brugt til RNA- eller DNA-ekstraktion og en anden til flow-cytometeranalyse.

I PBMC'erne isoleret fra forsøgspersonerne i de 3 undersøgelsesgrupper analyserede efterforskerne:

• CB1- og CB2-proteinekspression;
• ekspression af følgende gener: CB-receptorer, FAAH, NAPE-PLD, MAGL og DAGL
• DNA-methylering af ES-komponenter. For at bestemme det relative niveau af CB1- og CB2-proteinekspression i PBMC'er brugte efterforskerne flowcytometri med et FACS Canto flow-cytometer (Becton-Dickenson). Efter isolering blev celler (100.000 pr. reaktion) farvet under anvendelse af antistoffer mod CD45 (BD Biosciences, 1:50), CB1 (R&D-system, 1:50) og CB2-receptorer (Cayman Chemical, 1:30); i alt 10.000 hændelser blev talt i vinduer, der var lukket for krydsningen af ​​CD45-farvning med CB1 og CB2.

Totalt RNA fra PBMC'er blev isoleret ved hjælp af standardprocedure (Zymo Research), og RNA-kvalitet blev vurderet ved hjælp af et nanodrop-spektrofotometer (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific); cDNA blev genereret ved hjælp af iScript cDNA Synthesis kit (Biorad) efter leverandørens instruktioner. Genekspression af CB-receptorer, FAAH, NAPE-PLD, MAGL og DAGL blev analyseret ved hjælp af Fast Eva Green supermix (BIO-RAD). Ubiquitin (UBC), hvis ekspression forblev konstant i alle eksperimentelle grupper, blev brugt som husholdningsgen. Amplifikationen blev udført med et let Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System (Roche) efter leverandørens instruktioner. Alle prøver blev analyseret i tre eksemplarer, og genekspressionsniveauer blev beregnet i henhold til 2-∆Ct = 2- (Ct-gen - Ct-husholdningsgen) formel ved at bruge Ct-værdier.

Da PBMC'er indeholder det fulde komplement af epigenetiske enzymer, der findes i de fleste væv, herunder neuroner og perifere nukleerede celler, evaluerede efterforskerne rollen af ​​DNA-methylering i reguleringen af ​​ES-gentransskription i alle de tilmeldte forsøgspersoner.

DNA blev ekstraheret fra fuldblod ved hjælp af QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen), og dets koncentration blev bestemt ved NanoDrop kvantificering (NanoDrop Techologies, Thermofisher). Arrays forberedelse og dataanalyse blev udført af Genomix4Life srl (Baronissi, Italien). Højkvalitets-DNA (500 ng) blev bisulfit-konverteret ved hjælp af EZ DNA-methyleringskit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Bisulfit-konverteret DNA (200ng) blev brugt til analyse af hel-genom-methylering under anvendelse af HumanMethylation 450 K BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA), som indeholder 485 577 prober, der dækker 21 231 (99%) RefSeq-gener. Kort fortalt blev bisulfit-konverteret DNA hel-genomamplificeret i 20 timer efterfulgt af endepunktsfragmentering. Fragmenteret DNA blev præcipiteret, denatureret og hybridiseret til BeadChips i 20 timer ved 48 °C. BeadChips blev vasket, og de hybridiserede primere blev forlænget og mærket før scanning af BeadChips ved hjælp af Illumina iScan-systemet. GenomeStudio software (version 2011.1; Illumina Inc.) blev brugt til ekstraktion af DNA-methyleringssignaler fra scannede arrays. Methyleringsniveauet for hver cytosin blev udtrykt som en beta-værdi beregnet som fluorescensintensitetsforholdet for de methylerede til ikke-methylerede versioner af proberne: beta-værdier lå mellem 0 (umethyleret) og 1 (methyleret). Annoteringen vedrørende CGI'er bruger følgende kategorisering: 'shore', hver af de 2-kb sekvenser, der flankerer en CGI; 'hylde', hver af 2-kb-sekvenserne ved siden af ​​en kyst; 'åbent hav', DNA, der ikke er inkluderet i nogen af ​​de foregående sekvenser eller i CGI'er 4. TSS200 og TSS1500 angiver området mellem henholdsvis position -200 bp og -1500 bp fra TSS. Den signifikante methyleringsforskel mellem to givne loci er angivet med en delta-beta-værdi og bestemt med GenomeStudio Methylation Module ved hjælp af Illumina brugerdefineret algoritme til beregning af DiffScores (DiffScore⩽-30.0 (≈ pval <0,001)=hypomethylering; DiffScore⩾30,0 (≈ p val<0,001)=hypermethylering).