发作性和慢性偏头痛患者内源性大麻素系统的基因表达

偏头痛是一种神经血管疾病，其病理生理学远未完全阐明。 这主要是由于偏头痛发作及其复发背后的复杂机制。 内源性大麻素系统 (ES) 是一个复杂的信号系统，涉及不同的生物过程（例如 神经元活动、痛觉和免疫功能），它在维持身体稳态方面起着至关重要的作用。 ES 成分包括内源性脂质，研究最多的是 N-花生四烯酰乙醇胺 (AEA) 和 2-花生四烯酰甘油 (2-AG)、它们的代谢酶和至少两种大麻素受体（CB1 和 CB2）。 AEA 的生物合成主要通过 N-酰基磷脂酰乙醇酰胺-磷脂酶 D (NAPE-PLD) 进行，而 2-AG 则通过二酰基甘油脂肪酶 (DAGL) 的作用产生。 AEA 由脂肪酸酰胺水解酶 (FAAH) 代谢，2-AG 主要由单酰基甘油脂肪酶 (MAGL) 代谢。

在生理和病理条件下，ES 成分基因表达的改变可能涉及各种细胞类型、多种分解代谢途径和通过表观遗传机制产生活性代谢物。 例如，CB 基因可能与不同的转录因子相互作用，其中许多与 DNA 甲基化和组蛋白翻译后修饰有关。 功能失调的 ES 与包括偏头痛在内的多种疾病有关。 事实上，ES 调节多种活动和神经调节剂/神经递质，它们在偏头痛发病机制中起着至关重要的作用。 ES 还与来自脑干传入神经的三叉神经血管伤害性传递的下行调制有关。 帕维亚 IRCCS Mondino 基金会头痛科学中心综合自主系统神经生理学实验室先前的研究，使用基于大鼠硝酸甘油给药的偏头痛特异性动物模型，证明了 ES 与疼痛调节之间存在相互作用. 特别是，研究人员展示了 AEA 和 FAAH 调节的 AEA 活动在处理三叉神经痛觉信号中的关键作用。 AEA 抑制神经源性硬脑膜血管扩张，以及降钙素基因相关肽诱导和一氧化氮诱导的硬脑膜血管扩张，这种活性可被 CB1 拮抗作用逆转。 临床观察也表明了 ES 与偏头痛之间的相互作用。 FAAH 活性在患有发作性偏头痛 (EM) 的女性的血小板中更高，表明 AEA 的降解更显着。 患有慢性偏头痛 (CM) 和药物过度使用 (MO) 的受试者不仅在血小板中而且在 CSF 中都表现出内源性大麻素代谢的改变。 尽管上述临床发现是分散和重复的，但根据来自越来越多的临床前证据的最新数据重新考虑它们提示需要更深入地研究 ES 在偏头痛病理生理学中的作用。

多项研究表明，在外周血单核细胞 (PBMC) 中检测到的 ES 成分变化是不同神经系统疾病中 ES 中枢功能障碍的可靠指标。 例如，在患有帕金森病或多发性硬化症的患者中，脑脊液中 AEA 水平的升高与 PBMC 中 FAAH 活性和蛋白质含量的降低有关，这表明 AEA 基调升高。 AEA 水平在 CSF 和精神分裂症受试者的血液中升高，临床缓解后 AEA 血液水平和 PBMC 中 CB2 和 FAAH 的 mRNA 转录物显着下降。

本研究的目的是确定偏头痛患者 ES 活动的特定功能模式。 为此，研究人员对无先兆 EM、CM-MO 和健康对照 (CT) 受试者的代表性样本的 PBMC 中 ES 的多个外周成分（基因表达、蛋白质表达和 DNA 甲基化）进行了全面评估。

25 名患有 EM、26 名患有 CM-MO 和 24 名 CT 的受试者被纳入帕维亚 IRCCS Mondino 基金会（意大利）的头痛中心。 本研究经当地伦理委员会批准，所有入组受试者均签署了书面知情同意书。

血液样本 (20ml) 收集在含有乙二胺四乙酸 (EDTA) 的试管中。 用磷酸盐缓冲盐水 1X (PBS 1X) (Sigma) 以 1:1 的比例稀释血样。 将稀释的血液样本缓慢加载到 Ficoll 分离溶液 (15ml) (Sigma) 上，并在室温下以 800 g 无制动离心 30 分钟。 PBMC 积聚为中间白色单层，在无菌 PBS 1X 中洗涤两次并以 300 g 离心 15 分钟。 对于每个样本，一批 PBMC 用于 RNA 或 DNA 提取，另一批用于流式细胞仪分析。

在从 3 个研究组中的受试者分离的 PBMC 中，研究人员分析了：

• CB1和CB2蛋白表达；
• 以下基因的表达：CB 受体、FAAH、NAPE-PLD、MAGL 和 DAGL
• ES 成分的 DNA 甲基化。 为了确定 PBMC 中 CB1 和 CB2 蛋白表达的相对水平，研究人员使用流式细胞术和 FACS Canto 流式细胞仪 (Becton-Dickenson)。 分离后，使用针对 CD45（BD Biosciences，1:50）、CB1（R&D 系统，1:50）和 CB2 受体（Cayman Chemical，1:30）的抗体对细胞（每个反应 100000 个）进行染色；在为 CD45 染色与 CB1 和 CB2 的交叉点设门控的窗口中，总共计数了 10000 个事件。

使用标准程序 (Zymo Research) 分离 PBMC 的总 RNA，并使用 nanodrop 分光光度计 (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific) 评估 RNA 质量； cDNA 是按照供应商的说明使用 iScript cDNA 合成试剂盒 (Biorad) 生成的。 使用 Fast Eva Green supermix (BIO-RAD) 分析 CB 受体、FAAH、NAPE-PLD、MAGL 和 DAGL 的基因表达。 泛素（UBC），其表达在所有实验组中保持不变，被用作管家基因。 按照供应商的说明，使用 light Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System (Roche) 进行扩增。 所有样品一式三份测定，基因表达水平根据 2-ΔCt = 2-（Ct 基因 - Ct 持家基因）公式使用 Ct 值计算。

由于 PBMC 含有在大多数组织（包括神经元和外周有核细胞）中发现的全部表观遗传酶，研究人员评估了 DNA 甲基化在所有入选受试者中 ES 基因转录调节中的作用。

使用 QIAmp DNA Blood Mini Kit（Qiagen）从全血中提取 DNA，其浓度通过 NanoDrop 定量（NanoDrop Techologies，Thermofisher）测定。 阵列制备和数据分析由 Genomix4Life srl (Baronissi, Italy) 进行。 使用 EZ DNA 甲基化试剂盒 (Zymo Research, Irvine, CA, USA) 对高质量 DNA (500 ng) 进行亚硫酸氢盐转化。 亚硫酸氢盐转化的 DNA (200ng) 用于分析全基因组甲基化，使用 HumanMethylation 450 K BeadChip（Illumina，San Diego，CA，USA），其中包含 485 577 个探针，覆盖 21 231（99％）RefSeq 基因。 简而言之，将亚硫酸氢盐转化的 DNA 进行全基因组扩增 20 小时，然后进行终点片段化。 片段化的 DNA 沉淀、变性并在 48 °C 下与 BeadChips 杂交 20 小时。 在使用 Illumina iScan 系统扫描 BeadChip 之前，清洗 BeadChip 并延伸和标记杂交引物。 GenomeStudio软件（2011.1版； Illumina Inc.) 用于从扫描阵列中提取 DNA 甲基化信号。 每个胞嘧啶的甲基化水平表示为 beta 值，计算为探针的甲基化版本与未甲基化版本的荧光强度比：beta 值介于 0（未甲基化）和 1（甲基化）之间。 与 CGI 相关的注释使用以下分类：“shore”，每个 2-kb 序列位于 CGI 的两侧； 'shelf'，每一个 2-kb 的序列都在岸边； “公海”，未包含在任何先前序列或 CGI 4 中的 DNA。TSS200 和 TSS1500 分别表示距 TSS 的位置 -200 bp 和 -1500 bp 之间的区域。 两个给定基因座之间的显着甲基化差异由 delta-beta 值表示，并使用 GenomeStudio 甲基化模块使用 Illumina 自定义算法计算 DiffScores（DiffScore-30.0 (≈ pval <0.001)=低甲基化； DiffScore30.0 (≈ p val<0.001)=超甲基化)。