Expressão gênica do sistema endocanabinóide em pacientes com enxaqueca episódica e crônica

A enxaqueca é uma doença neurovascular cuja fisiopatologia está longe de ser completamente esclarecida. Isso se deve principalmente aos mecanismos complexos subjacentes ao ataque de enxaqueca, bem como à sua recorrência. O sistema endocanabinoide (SE) é um sistema de sinalização complexo envolvido em diferentes processos biológicos (p. atividade neuronal, sensação de dor e funções imunológicas) e desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase corporal. Os componentes do ES incluem os lipídios endógenos, sendo os mais estudados o N-araquidonoiletanolamida (AEA) e o 2-araquidonoilglicerol (2-AG), suas enzimas metabólicas e pelo menos dois receptores canabinóides (CB1 e CB2). A biossíntese do AEA ocorre principalmente pela N-acilfosfatidiletanolamida-fosfolipase D (NAPE-PLD), enquanto o 2-AG é produzido pela ação da diacilglicerol lipase (DAGL). O AEA é metabolizado pela amida hidrolase de ácidos graxos (FAAH) e o 2-AG principalmente pela monoacilglicerol lipase (MAGL).

Alterações na expressão gênica dos componentes do ES podem envolver vários tipos celulares, múltiplas vias catabólicas e a geração de metabólitos ativos por mecanismos epigenéticos, tanto em condições fisiológicas quanto patológicas. Os genes CB, por exemplo, podem interagir com diferentes fatores transcricionais, muitos dos quais estão relacionados à metilação do DNA e modificações pós-traducionais de histonas. Um ES disfuncional tem sido associado a vários distúrbios, incluindo enxaqueca. O ES, de fato, modula múltiplas atividades e neuromoduladores/neurotransmissores que desempenham um papel crucial na patogênese da enxaqueca. ES também está implicado na modulação descendente da transmissão nociceptiva trigeminovascular dos aferentes do tronco cerebral. Estudos anteriores do Laboratory of Neurophysiology of Integrative Autonomic Systems, Headache Science Centre, IRCCS Mondino Foundation, Pavia (Itália), usando o modelo animal específico da enxaqueca baseado na administração de nitroglicerina em ratos, demonstraram a existência de interações entre o ES e a mediação da dor . Em particular, os investigadores mostraram um papel fundamental para AEA e para a atividade de AEA regulada por FAAH no processamento de sinais nociceptivos trigeminal. AEA inibe a vasodilatação dural neurogênica, bem como a dilatação dos vasos durais induzida por peptídeos relacionados ao gene da calcitonina e induzida por óxido nítrico, uma atividade que é revertida pelo antagonismo de CB1. A interação entre ES e dor da enxaqueca também é sugerida por observações clínicas. A atividade da FAAH foi maior nas plaquetas de mulheres com enxaqueca episódica (EM) para sugerir uma degradação mais acentuada da AEA. Indivíduos com enxaqueca crônica (CM) e uso excessivo de medicamentos (MO) mostraram um metabolismo endocanabinóide alterado não apenas nas plaquetas, mas também no LCR. Embora os achados clínicos acima sejam dispersos e replicados, sua reconsideração à luz de dados mais recentes da crescente evidência pré-clínica leva à necessidade de investigar mais profundamente o papel do SE na fisiopatologia da enxaqueca.

Vários estudos sugerem que as alterações nos componentes do SE detectadas nas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são indicadores confiáveis ​​de uma disfunção central do SE em diferentes doenças neurológicas. Por exemplo, em pacientes com doença de Parkinson ou esclerose múltipla, os níveis aumentados de AEA no LCR foram associados a uma redução na atividade e no conteúdo proteico de FAAH em PBMCs, o que é indicativo de um tônus ​​aumentado de AEA. Os níveis de AEA foram elevados no LCR e no sangue de indivíduos esquizofrênicos, com uma queda significativa nos níveis sanguíneos de AEA e nos transcritos de mRNA de CB2 e FAAH em PBMCs após remissão clínica.

O objetivo deste estudo foi a identificação de padrões funcionais específicos da atividade ES em indivíduos com enxaqueca. Para tanto, os pesquisadores realizaram uma avaliação minuciosa de múltiplos componentes periféricos do ES (expressão gênica, expressão proteica e metilação do DNA) em PBMCs de amostras representativas de indivíduos com EM sem aura, CM-MO e em controles saudáveis ​​(CT).

Vinte e cinco indivíduos com EM, 26 com CM-MO e 24 CT foram inscritos no centro de dor de cabeça da Fundação IRCCS Mondino de Pavia (Itália). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local e todos os participantes inscritos assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido.

Amostras de sangue (20ml) foram coletadas em tubos contendo ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA) dos participantes. As amostras de sangue foram diluídas na proporção de 1:1 com tampão fosfato salino 1X (PBS 1X) (Sigma). As amostras de sangue diluídas foram carregadas lentamente em solução de separação Ficoll (15ml) (Sigma) e centrifugadas a 800 g sem freio por 30 min em temperatura ambiente. As PBMCs acumuladas como a monocamada branca intermediária foram lavadas duas vezes em PBS 1X estéril e centrifugadas a 300 g por 15 min. Para cada amostra, um lote de PBMCs foi usado para extração de RNA ou DNA e outro para análise de citômetro de fluxo.

Nas PBMCs isoladas dos indivíduos nos 3 grupos de estudo, os investigadores testaram:

• expressão da proteína CB1 e CB2;
• expressão dos seguintes genes: receptores CB, FAAH, NAPE-PLD, MAGL e DAGL
• Metilação do DNA de componentes ES. Para determinar o nível relativo da expressão das proteínas CB1 e CB2 em PBMCs, os investigadores usaram a citometria de fluxo com um citômetro de fluxo FACS Canto (Becton-Dickenson). Após o isolamento, as células (100.000 por reação) foram coradas com anticorpos contra receptores CD45 (BD Biosciences, 1:50), CB1 (R&D system, 1:50) e CB2 (Cayman Chemical, 1:30); um total de 10.000 eventos foram contados em janelas fechadas para a interseção da coloração de CD45 com CB1 e CB2.

O RNA total de PBMCs foi isolado usando o procedimento padrão (Zymo Research) e a qualidade do RNA foi avaliada usando um espectrofotômetro nanodrop (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific); O cDNA foi gerado usando o kit iScript cDNA Synthesis (Biorad) seguindo as instruções do fornecedor. A expressão gênica dos receptores CB, FAAH, NAPE-PLD, MAGL e DAGL foi analisada usando o supermix Fast Eva Green (BIO-RAD). A ubiquitina (UBC), cuja expressão permaneceu constante em todos os grupos experimentais, foi utilizada como gene de manutenção. A amplificação foi realizada com um Light Cycler 480 Instrument rt-PCR Detection System (Roche) seguindo as instruções do fornecedor. Todas as amostras foram testadas em triplicata e os níveis de expressão gênica foram calculados de acordo com a fórmula 2-∆Ct = 2- (Ct gene - Ct housekeeping gene) usando valores de Ct.

Como as PBMCs contêm o complemento total de enzimas epigenéticas encontradas na maioria dos tecidos, incluindo neurônios e células nucleadas periféricas, os pesquisadores avaliaram o papel da metilação do DNA na regulação da transcrição do gene ES em todos os indivíduos inscritos.

O DNA foi extraído do sangue total usando QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) e sua concentração foi determinada por quantificação NanoDrop (NanoDrop Techologies, Thermofisher). A preparação das matrizes e a análise dos dados foram realizadas por Genomix4Life srl (Baronissi, Itália). O DNA de alta qualidade (500 ng) foi convertido em bissulfito usando o kit EZ DNA methylation (Zymo Research, Irvine, CA, EUA). O DNA convertido em bissulfito (200ng) foi usado para análise da metilação de todo o genoma, usando o HumanMethylation 450 K BeadChip (Illumina, San Diego, CA, EUA), que contém 485.577 sondas cobrindo 21.231 (99%) genes RefSeq. Em resumo, o DNA convertido em bissulfito foi amplificado por todo o genoma por 20 h, seguido de fragmentação do ponto final. O DNA fragmentado foi precipitado, desnaturado e hibridizado com os BeadChips por 20 h a 48 °C. Os BeadChips foram lavados e os primers hibridizados foram estendidos e marcados antes de escanear os BeadChips usando o sistema Illumina iScan. Software GenomeStudio (versão 2011.1; Illumina Inc.) foi usado para a extração de sinais de metilação de DNA de matrizes digitalizadas. O nível de metilação para cada citosina foi expresso como um valor beta calculado como a proporção de intensidade de fluorescência das versões metiladas para não metiladas das sondas: os valores beta variaram entre 0 (não metilado) e 1 (metilado). A anotação relativa aos CGIs usa a seguinte categorização: 'shore', cada uma das sequências de 2 kb flanqueando um CGI; 'prateleira', cada uma das sequências de 2 kb próximas a uma costa; 'mar aberto', DNA não incluído em nenhuma das sequências anteriores ou em CGIs 4. TSS200 e TSS1500 indicam a região entre as posições -200 pb e -1500 pb do TSS, respectivamente. A diferença significativa de metilação entre dois loci fornecidos é indicada por um valor delta-beta e determinada com o GenomeStudio Methylation Module usando o algoritmo personalizado Illumina para calcular DiffScores (DiffScore⩽-30,0 (≈ pval <0,001)=hipometilação; DiffScore⩾30,0 (≈ p val<0,001)=hipermetilação).